2019年2月5日，清華大學藥學院饒燏課題組與中科院生物物理研究所姬廣聚組及北京大學肖瑞平、張秀琴組合作在Cell discovery《細胞發(fā)現(xiàn)》期刊在線發(fā)表了最新研究成果《基于化學手段實現(xiàn)從小鼠到非人靈長類的全身蛋白敲低》（A Chemical Approach for Global Protein Knockdown from Mice to Non-human Primates）。該論文通過化學設計蛋白降解分子（PROTACs），快速可逆敲低動物體內蛋白（FKBP12），并首次成功實現(xiàn)恒河猴體內蛋白快速敲降。
動物的基因敲除是常見的研究手段之一。目前，常見的敲除手段如TALEN，Cre-LoxP，CRISPR-Cas9等是從基因組進行敲除，RNA干擾的方式則是從轉錄水平進行敲降。而這些方法通常在構建大動物基因敲除模型，尤其是非人靈長類上仍存在很大難度。此外，這些方法構建模型通常需要較長時間，且基因敲除引起的功能喪失多是不可逆的。而且基因敲除模型中潛在的基因補償和/或自發(fā)突變可能導致功能誤讀。某些特定基因的全身性敲除會出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常甚至死亡的現(xiàn)象，影響出生后的實驗研究。
PROTAC（Proteolysis-Targeting Chimera）技術通過招募E3泛素連接酶，利用自身的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)實現(xiàn)對靶向特定蛋白的降解。FKBP12（FK506 binding protein 12）是能與大環(huán)內酯類免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結合，并在哺乳動物中廣泛表達的一類蛋白，該蛋白與鈣離子通道受體-蘭尼堿受體結合，使鈣離子通道處于穩(wěn)定的關閉狀態(tài)，當FKBP12從RyRs解離后，RyRs開放，釋放鈣離子，從而通過鈣信號通路實現(xiàn)對機體重要功能的調控。FKBP12重要功能之一是參與心臟發(fā)育，對心肌細胞表型分化、心臟結構形成和心臟搏動的啟動發(fā)揮重要的調節(jié)作用。胚胎期心臟缺失FKBP12時會引起嚴重的發(fā)育性心室缺損，導致胚胎死亡。因此全身敲除FKBP12在成年鼠心臟中的功能研究還不完全，且并沒有敲除大動物FKBP12的研究。
圖1. PROTACs原理示意圖及所設計分子活性測定
在本文中，首次利用PROTACs這一化學技術實現(xiàn)動物體內靶蛋白的全身敲低，快速構建了小鼠、大鼠、豬和恒河猴的FKBP12蛋白全身敲低模型，并在小鼠及恒河猴對FKBP12蛋白功能進行了研究和驗證。其中小鼠及大鼠體內FKBP12蛋白僅用一天，香豬體內FKBP12僅用兩天，恒河猴體內FKBP12僅用三天即可全身高效率全身敲低。此外，本文中首次驗證PROTACs可在口服給藥途徑中保持高效蛋白降解功能。腦室給予PROTACs時可實現(xiàn)腦內FKBP12的條件性敲除。若停止給予PROTAC，則動物體內蛋白可逐漸恢復，這有利于動物模型自身對照，對于蛋白功能研究更為準確。本文還將此方法應用于其他靶蛋白的全身敲低，如BTK蛋白。因此，該PROTAC技術是當前基因敲除方法的有效補充，因其快速可逆可控實現(xiàn)體內外蛋白全身敲低，是極有應用前景。
圖2. 利用所設計PROTAC對恒河猴FKBP12全身敲低及停藥后蛋白恢復
哈佛大學醫(yī)學院魏文毅教授在Cell Research期刊上評論該工作時指出由于PROTAC技術是直接通過內源E3連接酶和泛素化系統(tǒng)將引起癌癥的靶蛋白降解，因此該技術可以克服傳統(tǒng)方法如CRISPR, RNAi和小分子抑制劑的不足，是引領新一代醫(yī)藥開發(fā)的新技術。目前FDA已經批準第一例口服PROTAC(ARV-110)進入臨床一期研究，通過降解雄激素受體治療前列腺癌。但目前缺乏對PROTAC的系統(tǒng)研究及動物層面的臨床前研究，尤其是大動物上的評價。所以該工作實現(xiàn)了PROTAC技術從小鼠、豬到恒河猴的系統(tǒng)探索，填補了PROTAC技術臨床前研究的空白，為其應用于臨床治療人類腫瘤提供了指導，奠定了堅實基礎，同時為體內蛋白功能研究提供了一種新穎、高效、快速、可逆且低成本的強有力工具。
圖3. 從DNA, RNA和蛋白質水平抑制腫瘤相關基因的策略總結
清華大學饒燏教授和姬廣聚教授，張秀琴教授為本論文共同通訊作者。饒燏課題組、清華-北大生命聯(lián)合中心博士后孫秀云、中科院生物物理所博士生王珺及饒燏課題組博士生姚霞為本文并列第一作者。該研究得到了國家自然科學基金和國家重大新藥創(chuàng)制項目的大力支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-018-0079-1
