近日，清華大學(xué)藥學(xué)院唐葉峰課題組與北京全球健康藥物研發(fā)中心陳爍團(tuán)隊(duì)、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤課題組共同合作，在《ACS Chem Biol》上發(fā)表了題為“天然產(chǎn)物吲哚霉素及其合成衍生物的抗結(jié)核分枝桿菌作用研究”的重要研究成果。該研究首次詳細(xì)揭示了吲哚霉素對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抑菌活性和分子水平的作用機(jī)理，以及分枝桿菌可能產(chǎn)生的抗藥頻率和其機(jī)理，為發(fā)展新型抗結(jié)核藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
研究背景
在新型冠狀病毒肺炎全球大流行的背景下，人類結(jié)核病的感染和病亡率也在不斷升高，社會(huì)對(duì)抗結(jié)核藥物的研發(fā)有著更為緊迫的要求。吲哚霉素（indolmycin，IND）是灰色鏈霉菌產(chǎn)生的天然抗生素，它能選擇性地抑制病原細(xì)菌的色氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶TrpRS，但未見(jiàn)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒副作用。TrpRS是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的必需關(guān)鍵酶，它與近年來(lái)引起關(guān)注的一系列色氨酸生物合成酶都是開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物的重要靶點(diǎn)。基于作者對(duì)鏈霉菌天然產(chǎn)物和色氨酰tRNA合成酶抑制劑的研究經(jīng)驗(yàn)，本研究首次詳細(xì)揭示了吲哚霉素對(duì)分枝桿菌的抑菌活性和分子水平的作用機(jī)理，以及分枝桿菌可能產(chǎn)生的抗藥頻率和及其機(jī)理等。該研究通過(guò)建立生化實(shí)驗(yàn)分析了多種全化學(xué)合成的吲哚霉素類似物，發(fā)現(xiàn)多個(gè)類似物的最低抑菌濃度（MIC）較起始天然產(chǎn)物降低了7～14倍。其中，4’-甲基化吲哚霉素（Y-13）的MIC較穩(wěn)定，且達(dá)到0.5μg/ml，并能與色氨酸生物合成途徑中TrpE的變構(gòu)抑制劑吲哚丙酸（IPA）產(chǎn)生協(xié)同作用，能更有效地殺死體外分枝桿菌，提示針對(duì)病原體色氨酸合成和蛋白合成途徑設(shè)計(jì)雙重抑制，能開(kāi)發(fā)一類新型抗生素有效應(yīng)對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌。
研究方法
通過(guò)異源表達(dá)純化獲得Mtb TrpRS蛋白，建立新型的不依賴于tRNA的生化實(shí)驗(yàn)以分析Mtb TrpRS的酶活性。同時(shí)，系統(tǒng)地分析了吲哚霉素對(duì)多種分枝桿菌（如Mtb、BCG和Msmeg等）的體外抑菌濃度，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性，以及對(duì)Mtb TrpRS的多種生化參數(shù)（IC50，Ki和KD）。吲哚霉素及光學(xué)純類似物經(jīng)改良的5步化學(xué)全合成路線制備。TrpRS蛋白與化合物在2.5?分辨率的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)中也被詳盡解析，作為建立結(jié)構(gòu)和活性相關(guān)性的基礎(chǔ)。在相關(guān)細(xì)菌學(xué)研究中，建立過(guò)量表達(dá)trpS基因的BCG菌株可以對(duì)化合物進(jìn)行靶向分析，還可以對(duì)其聯(lián)合用藥的協(xié)調(diào)作用進(jìn)行分析，也可以進(jìn)行時(shí)間依賴的動(dòng)態(tài)殺菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)體外篩選的BCG菌株和Msmeg抗吲哚霉素類似物突變株及其基因組進(jìn)行測(cè)序。
研究結(jié)果
一、對(duì)天然產(chǎn)物吲哚霉素的初步評(píng)價(jià)
天然產(chǎn)物吲哚霉素對(duì)慢生長(zhǎng)非結(jié)核分枝桿菌的MIC約為4μg/ml；只抑制少數(shù)病原菌生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏陰性菌和大部分腸道細(xì)菌沒(méi)有作用；在10倍MIC濃度下對(duì)動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有毒性。它的生化和物理化學(xué)指標(biāo)均達(dá)到了做藥物先導(dǎo)化合物的要求。
Figure 1. Structure of IND and initial assessments
二、建立Mtb TrpRS酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)及分析蛋白和配體的共晶結(jié)構(gòu)
TrpRS酶活反應(yīng)分為兩步：第一步，消耗ATP激活氨基酸，ATP和氨基酸在酶的催化下生成Trp-AMP和焦磷酸（PPi），中間體Trp-AMP與酶有高親和力的結(jié)合；第二步，以tRNA為受體，接收中間體中酰化的氨基酸的轉(zhuǎn)移，生成Trp-tRNA并釋放AMP，使得酶重新具有催化功能。在吲哚霉素抑制TrpRS實(shí)驗(yàn)中，研究人員用羥胺作為替代終受體以研究第一步的反應(yīng)速率，酶在此反應(yīng)中高效地激活Trp且不斷生成PPi。PPi被焦磷酸酶分解成磷酸根（Pi），用孔雀石綠試劑或EnzChek試劑盒可以測(cè)定Pi的生成來(lái)定量第一步反應(yīng)的速率及酶活（圖2 A-C）。研究人員測(cè)定了吲哚霉素針對(duì)Mtb TrpRS的IC50和Ki分別是1.0和0.34μM（圖2 D-E），說(shuō)明吲哚霉素對(duì)Mtb TrpRS具有較高結(jié)合和抑制作用。
Figure 2 Assay validation of PPi production in Mtb TrpRS reaction
另一方面，文章解析了Mtb TrpRS單體蛋白和蛋白與底物或吲哚霉素的共晶結(jié)構(gòu)，深入揭示了吲哚霉素的抑制機(jī)理。研究表明蛋白在無(wú)底物狀態(tài)下呈現(xiàn)開(kāi)放態(tài)（open state），蛋白與中間體Trp-AMP結(jié)合后呈現(xiàn)閉合態(tài)（closed state），而吲哚霉素與蛋白和ATP的共晶結(jié)構(gòu)顯示蛋白處在開(kāi)放和閉合之間的中間態(tài)（圖3 A）。比較三種狀態(tài)下的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ATP與Trp結(jié)合位點(diǎn)均有不同程度的改變（圖3 B-F），為下一步解釋化合物的構(gòu)效關(guān)系（SAR）和合理設(shè)計(jì)TrpRS抑制劑提供了基礎(chǔ)。
Figure 3 The structures and co-crystal structures of Mtb TrpRS
三、吲哚霉素類似物的化學(xué)合成和SAR探索
吲哚霉素結(jié)構(gòu)由3個(gè)組成部分：藍(lán)色的吲哚環(huán)、中間綠色的雜環(huán)和紅色的尾側(cè)鏈。該研究對(duì)吲哚霉素不同部分的基團(tuán)修飾和改變可能對(duì)其活性的影響進(jìn)行了充分的探討，設(shè)計(jì)并合成了28個(gè)吲哚霉素類似物（具體過(guò)程見(jiàn)原文），并利用表面等離子共振（SAR）技術(shù)對(duì)這些化合物的酶活進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果顯示，在吲哚環(huán)的R1位引入一些取代基團(tuán)，均能提高吲哚霉素類似物對(duì)Mtb TrpRS酶活能力和抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的能力，尤其是4’-甲基化的類似物Y-13分別在酶活和MIC上至少提高了3倍和6倍（表1）。
Table 1 Antimycobacterial activity of IND derivatives against M.bovis BCG and Mtb H37Rv
研究人員用蛋白和配體復(fù)合物的共晶結(jié)構(gòu)（圖4）解釋了吲哚環(huán)C-4上引入疏水的基團(tuán)（F，Cl和CH3），能夠提高吲哚霉素類似物抗菌活性的原因。雖然這些蛋白復(fù)合體整體結(jié)構(gòu)類似，但在不同C-4位取代下的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)有差異。相對(duì)于吲哚霉素，C-4位F和Cl的取代類似物能夠更好地適合空間，而在Br取代中，可能由于過(guò)大的原子半徑，使得Br與Q156殘基產(chǎn)生了空間位阻。在甲基取代的結(jié)構(gòu)中，不僅甲基基團(tuán)非常好的匹配了空間，同時(shí)3個(gè)C-H鍵也與側(cè)鏈的Q156殘基形成弱氫鍵結(jié)合（圖4F）。
Figure 4 Structure analysis of the C-4’substituted IND series compounds
四、吲哚霉素在結(jié)核分枝桿菌中對(duì)TrpRS的靶向性分析
該研究構(gòu)建ATc誘導(dǎo)表達(dá)TrpRS的BCG牛分枝桿菌，用來(lái)分析吲哚霉素及其類似物Y-13的MIC變化。與不受誘導(dǎo)相比較，在1μg/ml ATc的誘導(dǎo)下，吲哚霉素的MIC由19μM提高到了4.8mM；Y-13的MIC由11μM提高到了38μM。同樣條件下，對(duì)照菌株無(wú)論是否含有誘導(dǎo)劑均不會(huì)引起MIC的改變，從而證明吲哚霉素及其類似物在結(jié)核分枝桿菌中具有相同的靶點(diǎn)TrpRS（圖5）。
Figure 5 Dose-response profile of recombinant strains against IND and Y-13 in the absence or presence of ATc
五、吲哚霉素藥物聯(lián)用的殺菌活性分析
通過(guò)對(duì)牛分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)研究，研究人員測(cè)定了Y-13與多種抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用的殺菌情況。計(jì)算得出部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）和等效線圖（表2和圖6），發(fā)現(xiàn)Y-13與TrpE變構(gòu)抑制劑IPA聯(lián)用具有最好的協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)ICI達(dá)到了0.31。在測(cè)試的所有藥物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)拮抗劑。研究人員又對(duì)Y-13-IPA和Y-13-GSK656（LeuRS抑制劑）的協(xié)同用藥通過(guò)菌落計(jì)數(shù)的方式進(jìn)行了24d的生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)（圖7）。結(jié)果顯示Y-13與IPA聯(lián)用降低了15倍的菌落數(shù)，而殺菌效果是在14d后才逐漸顯示出來(lái)，提示吲哚霉素對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)生長(zhǎng)的分枝桿菌的代謝具有繼發(fā)性影響。
▲ Table 2 FICIs of pairwise combinations of Y-13 with TB drugs in vitro
Figure 6 Isobolograms of Y-13 in combination with IPA and streptomycin
Figure 7 In vitro kill kinetics of growth inhibitors against M. bovis BCG
六、分枝桿菌對(duì)吲哚霉素及其類似物耐藥性的分析
研究分析了吲哚霉素及其類似物引起分枝桿菌的自發(fā)突變率。在固體培養(yǎng)基中，分別設(shè)置了2倍、4倍和8倍MIC的藥物使用劑量。吲哚霉素及其類似物引起的細(xì)菌自發(fā)突變率都在10-8到10-9，優(yōu)于GSK656，遠(yuǎn)好于異煙肼（表3）。分離的5個(gè)具有吲哚霉素抗性生長(zhǎng)較快的恥垢分枝桿菌（Msmeg）菌株中，4個(gè)Msmeg菌株的trpS基因發(fā)生了H49N的突變（相對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的第50位組氨酸）。結(jié)構(gòu)分析顯示：H50N的突變能夠破壞π?πstacking與D141氫鍵的形成，從而影響吲哚霉素與TrpRS的結(jié)合。而在分離的19個(gè)有吲哚霉素抗性但生長(zhǎng)慢的牛分枝桿菌菌株中，trpS及其上游序列均未發(fā)生突變。為此研究選擇了5個(gè)牛分枝桿菌耐藥突變株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，對(duì)發(fā)現(xiàn)的6種突變基因（表4）歸納為以下3種類型：涉及色氨酸生物合成的TrpE和CM（分支酸變位酶）、涉及脂肪酸生物合成和細(xì)胞壁脂代謝的PpsA和TesA，以及涉及中心碳代謝和細(xì)胞呼吸功能的GlpK和FrdC。這些基因突變可以用來(lái)解釋慢生長(zhǎng)分枝桿菌對(duì)吲哚霉素類似物產(chǎn)生抗藥性和耐藥性的原因，并提示結(jié)核分枝桿菌嚴(yán)格控制其細(xì)菌胞內(nèi)的色氨酸合成。
Table 3 Frequency of spontaneous resistant mutants of M. bovis BCG raised against the compound
Table 4 Mutations in the IND resistant mutants of M.bovis BCG, identified by whole-genome sequencing
研究按照基因組挖掘鏈霉菌天然產(chǎn)物的邏輯，尋找具有生物活性和特異靶點(diǎn)的抗結(jié)核先導(dǎo)化合物。研究者以抑制Mtb TrpRS的吲哚霉素為例建立并展示了相關(guān)技術(shù)路線和平臺(tái)，包括功能性生化測(cè)試、化學(xué)合成及化合物構(gòu)效關(guān)系、蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞活性和毒性測(cè)試、細(xì)菌內(nèi)靶向分析、細(xì)菌抗藥體外發(fā)生頻率、細(xì)菌抗藥機(jī)理，以及對(duì)與抗結(jié)核藥物體外聯(lián)用的評(píng)價(jià)等。雖然改進(jìn)后的吲哚霉素類似物具有較好的體外抗結(jié)核活性，并且其他很多物化指標(biāo)也均達(dá)到了口服藥物標(biāo)準(zhǔn)（如口服抗幽門螺桿菌藥物），其專一的抗菌譜也意味著未來(lái)吲哚霉素類藥物可能僅限于治療慢生長(zhǎng)非結(jié)核分枝桿菌感染。另一方面，成千上萬(wàn)的鏈霉菌基因組已經(jīng)被測(cè)序并存放在公共數(shù)據(jù)庫(kù)里，各類型鏈霉放線菌菌種收藏中心早已建立，現(xiàn)在從事抗結(jié)核早期藥物開(kāi)發(fā)的研究人員完全可以通過(guò)本文的方法找到作用于遺傳信息傳遞鏈里的靶點(diǎn)，以及具有很好細(xì)胞活性的先導(dǎo)化合物。
