2022年1月1日，清華大學藥學院錢鋒課題組在藥物遞送領域的知名期刊 《Theranostics》在線發(fā)表題為“巨胞飲葡聚糖協(xié)助藥物在KRAS突變胰腺癌中的靶向遞送”（Macropinocytic dextran facilitates KRAS-targeted delivery while reducing drug-induced tumor immunity depletion in pancreatic cancer）的科研論文。胰腺癌內部復雜的微環(huán)境中包含了腫瘤細胞和非腫瘤細胞等多種組分，設計合適的遞送系統(tǒng)，選擇性地將細胞毒性藥物傳遞給癌細胞，并限制其對腫瘤微環(huán)境中的抑癌良性細胞，如效應淋巴細胞的附帶損傷，具有重要的價值。胰腺癌細胞具有致癌基因KRAS突變，可誘導細胞產(chǎn)生高水平的巨胞飲。受到癌細胞這種異常行為的啟發(fā)，作者試圖探索葡聚糖（Dextran，一種被認為以巨胞飲依賴的方式內吞的生物材料）的靶向潛力。首先研究了不同分子量葡聚糖的入胞偏好、機制和亞細胞分選。然后將雷公藤甲素(一種有效的細胞毒素Triptolide)作為葡聚糖偶聯(lián)的模型藥物分子。通過體外細胞研究和體內腫瘤模型評估，研究了葡聚糖偶聯(lián)TP對KRAS基因的選擇性和胰腺癌的治療效果。
70kDa的葡聚糖具有更好靶向KRAS的潛力
在體外細胞實驗中，作者測定了巨胞飲抑制劑EIPA作用前后，4kDa, 70kDa, 150kDa等不同分子量的葡聚糖在兩個KRAS突變細胞(MIAPaCa-2和Panc-1)和兩個KRAS野生型細胞(BxPC-3和NIH3T3)的入胞效率。發(fā)現(xiàn)70kDa的葡聚糖在所有的測試細胞系中都表現(xiàn)出普遍的EIPA敏感性和巨胞飲的內吞依賴性。相比之下，雖然4kDa和150kDa的葡聚糖可以通過大胞飲作用內化到一些細胞中(4kDa的葡聚糖進入BxPC-3細胞(圖1A)，150kDa的葡聚糖進入NIH3T3細胞(圖1C))，但它們與70kDa葡聚糖的依賴水平不同。
圖1 70kDa的Dextran具有更顯著的KRAS靶向性 （A: 4kDa Dextran, B:70kDa Dextran, C: 150kDa Dextran）
作者通過酯鍵的方式將小分子藥物TP與70kDa的Dextran進行了偶聯(lián)（圖2 A和B），通過比較TP和DEX-TP對BxPC-3和BxPC-3 KRASG12V細胞的療效，發(fā)現(xiàn)DEX-TP對KRAS突變表現(xiàn)出更強的藥物療效(圖2C)，而TP沒有選擇性(圖2D)。
由于內吞轉運的動力學，葡聚糖的偶聯(lián)導致了藥物效價的降低，即藥物半抑制濃度的增加。作者設定了新的公式以定量評估DEX-TP內吞轉運的效率，更高的內吞轉運的效率值表明更顯著的內吞轉運過程。在實驗中，KRAS突變型細胞與KRAS野生型細胞之間的DEX-TP細胞沉積效率存在高達3-10倍的明顯差距。對于KRAS突變型癌細胞，其DEX-TP沉積效率在5.9到7.3之間；然而，對于KRAS野生型細胞，這些值的范圍為0.2到2（圖2E）。
作者進一步研究了KRAS對DEX-TP體內療效的影響。建立來自MIAPaCa-2、BxPC-3和BxPC-3 KRASG12V細胞的皮下異種移植模型，平行比較了DEX-TP和TP的抗腫瘤作用。在這些比較中，作者觀察到只有在KRAS突變的細胞來源的異種移植模型中，即MIAPaCa-2-(圖2F)和BxPC-3 KRASG12V(圖2H)的模型中，DEX-TP的腫瘤生長抑制率高于游離TP。然而，與之形成鮮明對比的是，在BxPC-3 的異種移植模型中并不存在這種差異，作者觀察到DEX-TP并沒有改善TP的治療效果(圖2G)。然而，一旦重新引入致癌的KRASG12V，治療差異再次出現(xiàn)(圖2H)。
圖2 DEX-TP增強了對KRAS突變胰腺癌細胞的毒性和對腫瘤生長的抑制能力
利用熒光素酶表達原位的MIAPaCa-2作者構建了原位的胰腺癌模型，用以進一步評估DEX-TP的治療效果，記錄腫瘤生長（生物發(fā)光監(jiān)測）和小鼠生存情況，同時比較dex-TP、游離TP和PDAC一線化療藥物GEM等治療方法(圖3A)。
基于熒光圖像，給藥量0.3mg/kg和1.0mg/kg 的DEX-TP在整個實驗過程中都顯著抑制了腫瘤生長(圖3B和4C)。在第22天治療結束時，1.0mg/kg DEX-TP顯示出優(yōu)于GEM的抗腫瘤優(yōu)勢(圖3D)。而且在治療期間，沒有觀察到DEX-TP治療的安全性問題或體重下降。與之相對比，GEM和TP治療組，每一組均發(fā)生了與藥物相關的小鼠死亡。
圖3 DEX-TP增抑制了胰腺原位MIAPaCa-2腫瘤的生長
作為藥物分子，雷公藤甲素的不良作用之一是對白細胞的抑制作用，TP作為一種免疫抑制因子，已在中藥中應用于自身免疫性疾病的治療數(shù)百年。然而，癌癥治療正傾向于利用免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤的進展。由于葡聚糖被證明可以提高TP的癌細胞選擇性，作者想知道這些偶聯(lián)物是否會以一種更有利于免疫系統(tǒng)的方式表現(xiàn)出來。在實驗中作者采用免疫活性KPC異體移植小鼠模型來研究DEX-TP對腫瘤微環(huán)境的影響(圖4A)。KPC同種異體移植瘤具有一些臨床相關的病理特性，如明顯纖維化和多成分組成。葡聚糖偶聯(lián)藥物組治療后的總生存率高于游離藥物治療(圖4B)。
此外，兩種治療對腫瘤免疫反應有很大的不同，這從免疫細胞標志物CD8、CD4、CD3和CD45等抗腫瘤效應細胞因子IFN-γ和TNF-α等抗腫瘤效應因子的表達水平升高可以看出。對于游離TP，觀察到明顯的免疫抑制表型，而對于DEX-TP，這種損傷明顯被逆轉（圖4 C和D）。
圖4 DEX-TP對KPC異體移植原位腫瘤模型的治療作用
目前雖然通過比較不同分子量的葡聚糖，篩選出了70kDa的Dextran能夠更有效地靶向KRAS突變癌細胞進行藥物遞送，但是這一結果缺乏在物理化學和分子生物學層面的理論研究支持。不同分子量的葡聚糖是由于何種原因，如分子半徑、側鏈分布、表面電荷、細胞表面作用蛋白等因素導致了在細胞內吞過程中行為的差于尚且沒有研究清楚。
為了更深入地研究導致細胞內吞過程中載體地選擇性問題，之后通過利用更全面的研究手段，如透射電鏡和動態(tài)激光散射確定不同分子量葡聚糖的分子半徑，表面電荷。通過對細胞不同的內吞方式進行選擇性抑制，鑒別各種分子量的葡聚糖主要的入胞方式。在此基礎上更清晰地解釋在癌細胞內吞過程中藥物大分子本身性質所導致的生物學行為差異。
