研究背景
- 作為細胞的重要組成成分，蛋白質是由不同氨基酸按照一定的順序排列形成的，氨基酸順序不同會導致蛋白質的空間結構不同，結構決定功能，從而形成成千上萬種具有不同功能的蛋白質，滿足正常的生命活動。
- 其次，某種蛋白質氨基酸序列改變——即使是單個氨基酸的突變或者修飾——會使蛋白質的功能發(fā)生改變，進而影響正常的生命活動，像大多數癌癥都是由于基因突變導致蛋白質氨基酸改變而引起的。
- 最后，某些蛋白質也可以作為藥物和生物標志物，作為疾病早期檢測的指標。
綜上可知蛋白質序列的研究對于預測蛋白質結構，疾病的檢測和蛋白質類藥物的開發(fā)具有重要意義。
目前能夠用于的蛋白質測序方法有質譜測序和 Edman 降解法。質譜法和 Edman 降解法操作過程復雜、樣品需求量大、純度要求高、耗時較長、通量低，且 Edman 降解法不能檢測 N 端氨基被封閉的樣品，且僅僅只能檢測 50 個氨基酸長度的多肽。
然而，蛋白質在生物體中都是以混合物的形式存在，而生物體內也存在稀有的蛋白質突變；另一方面，前蛋白質還沒有像 DNA 和 RNA 那樣可以通過 PCR 方法實現擴增的技術。鑒于此，對于這些稀有蛋白質因濃度過低和純度較差而不能用目前的蛋白質測序技術進行測序，急需一種高通量、低成本、樣品需求少、操作簡單的蛋白質測序技術。
論文概述
本文巧妙利用解旋酶控制 DNA 的運動，進而控制其所鏈接的多肽按照氨基酸線性順序通過一個納米孔道，進而得以通過電信號的變化檢出其氨基酸序列。
這種檢測技術實現了 17 個氨基酸長度多肽檢測，在中性多肽骨架中，雖然沒有實現單氨基酸的精確分辨，但是可以非常明顯的區(qū)分帶負電的氨基酸，例如天門冬氨酸，谷氨酸和磷酸化的絲氨酸。同時也發(fā)現了多肽測序中不同電荷對多肽運動的影響。此外，本文發(fā)現解旋酶 (helicase) 的雙聚體可以實現對同一多肽的反復測序，這為進一步提高多肽測序的準確率奠定了基礎。
圖1. 文章作者巧妙利用解旋酶控制 DNA 的運動進而控制其所鏈接的多肽按照氨基酸線性順序通過 MspA 納米孔。該方法的重點在于使用一個適合回溯測序的 DNA 動力蛋白，例如本文所使用的 MTA 解旋酶，以及一個檢測區(qū) (constriction) 在蛋白通道底部的納米孔蛋白，例如 MspA-M2 納米孔。
由于 MspA 的檢測區(qū)到頂端的距離較長，因此為了檢測更長的多肽，該文作者們選擇 MspA-M2 作為檢測時所用的納米孔。他們合成了不同長度的多肽，在多肽一端加上 ssDNA，另一端添加上 ployT；當 polyT 的信號被檢測到時即證明多肽已被檢測完全。
經過數據統(tǒng)計發(fā)現，當達到 17aa 時 polyT 信號的出現概率還在 50% 以上，但對于 18aa 和 19aa 而言 polyT 信號已幾乎檢測不到。如此可以認為該方法可檢測的多肽長度為 17aa。
為了進一步增加測序的長度，作者們將 MTA 解旋酶 (MTA-h) 融合表達。雖然結果顯示檢測的長度并未增加，但可以發(fā)現對于同一多肽鏈可以多次讀取。可能的原因是，在雙酶系統(tǒng)中，當多肽到達下方的 MTA-h 時，下方的 MTA-h 遠離 MspA-M2 頂端，使得上方的 MTA-h 瞬間下降，而由于上方的 MTA-h 仍然結合在 ssDNA 上，因此可以再次使多肽鏈勻速地通過 MspA-M2 的檢測區(qū)，從而實現了多次檢測。該種測序方法對于提高測序的準確度具有十分重要的意義。
作者們在該多肽鏈的 5 和 9 號位分別進行了單突變構建及磷酸化修飾，同時在 5、6 位點進行了雙突變；當 5 號為突變成酸性氨基酸，或被磷酸化修飾后，電流波形圖上均會產生一個小駝峰（相較于氨基酸突變及非磷酸化的情況）；當 9 號為突變成酸性氨基酸并發(fā)生磷酸化修飾后，也會產生較 5 號位后移的一個小駝峰；當 5、6 號位雙突變成酸性氨基酸時，小駝峰的信號會進一步增強。
幾乎所有的中性或者帶有酸性氨基酸殘基的多肽信號中都普遍出現了位于“DNA-多肽”信號轉換區(qū)的大量毛刺型電流振蕩，而堿性氨基酸 K 或 R 的突變卻未發(fā)生明顯的代表電流振蕩的毛刺現象。其中的原因可能是 DNA-多肽轉換區(qū)中存在著一個從強負電荷到中性或者弱電荷的轉換。在這一過程中，原先的 DNA 在電場中受到的拉伸作用有可能被迅速地釋放，從而形成類似于彈簧松弛的振蕩。另一方面，K 或 R 的正電荷在電場中產生了一個對于多肽向上的推力，使得這一轉化過程縮短或者抑制了振蕩。
小結
與最近發(fā)表在 Nano Letter 和 Science 上的兩篇論文類似，本文也展示了通過 DNA 馬達控制“DNA-解旋酶”穿過 MspA 納米孔的工作，進而獲得與序列相關的電流信號。不同的是，本文選擇了非帶電的多肽骨架，因此發(fā)現了與前文截然不同的信號模式。
當不帶電或所帶電荷較少的多肽鏈通過納米孔時，其過孔電流信號并不像 DNA 和 RNA 那樣具有明顯的電流臺階信息（其原因有可能是這類多肽骨架在 MspA-M2 的檢測區(qū)并不以被拉伸的狀態(tài)存在），所產生的電流可能是多個氨基酸的貢獻；這類多肽骨架上的負電荷突變（比如 D、E 以及磷酸化可以產生的增強電流）可能也與電場對多肽的局部拉伸有關。
本文還觀測到了非常有趣的振蕩電流現象；當存在帶正電荷的氨基酸殘基時，這類振蕩電流會消失，也從側面說明了電荷對多肽運動行為的重要影響。因此，本文進行了非常系統(tǒng)的可控多肽過孔研究，與此前的兩篇文獻進行印證，證明了多肽在檢測區(qū)拉伸的重要性。
在將來，為了能成功區(qū)分出不同的氨基酸，一方面可以改善納米孔的分辨率，另一方面可以利用電滲流的方法將多肽鏈拉伸，這些改進將為低成本單分子肽測序技術的開發(fā)鋪平道路，在科學發(fā)現和臨床應用方面擁有巨大的潛力。
論文信息
Controlled movement of ssDNA conjugated peptide through Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopore by a helicase motor for peptide sequencing applicationZhijie Chen, Zhenqin Wang, Yang Xu, Xiaochun Zhang, Boxue Tian and Jingwei Bai*（白凈衛(wèi)，清華大學）
Chem. Sci., 2021
http://doi.org/10.1039/D1SC04342K
原文鏈接：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2021/SC/D1SC04342K
