2023年4月5日，王釗教授課題組以“Ellagic acid ameliorates cisplatin-induced acute kidney injury by regulating inflammation and SIRT6/TNF-α signaling”為題在食品科技領(lǐng)域?qū)I(yè)期刊Food Science and Human Wellness雜志在線發(fā)表研究論文。王釗教授課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶SIRT6的過表達(dá)可以抵抗腎臟損傷（發(fā)表于Kidney International），基于此，本文發(fā)現(xiàn)一種廣泛存在于各種漿果、堅果中的天然多酚——鞣花酸，可作為SIRT6激活劑，通過調(diào)控SIRT6/TNF-α通路減緩抗腫瘤藥物順鉑引發(fā)的腎臟毒副作用，從而為臨床治療及靶向SIRT6藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。
研究背景
鉑類藥物是一類經(jīng)典的抗腫瘤藥物，其可通過抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成和RNA轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂阻滯和凋亡，進(jìn)而具有較好的抗腫瘤活性。然而在臨床應(yīng)用中逐漸發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物會產(chǎn)生較為嚴(yán)重的毒副作用，特別是腎臟毒性。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，使用鉑類藥物順鉑（Cisplatin）治療的患者中，腎損傷的發(fā)生率超過30%，因此亟需尋找一種緩解順鉑腎毒性的有效治療策略。SIRT6（Sirtuin 6）是一種依賴于NAD+的組蛋白去乙酰化酶，在基因表達(dá)調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、炎癥和細(xì)胞代謝等多種生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SIRT6可通過去乙酰化抑制ERK1/2的表達(dá)，阻斷下游的NF-κB和p53信號通路，從而減輕順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷。然而，目前還沒有獲批應(yīng)用于臨床治療的SIRT6特異性激活劑。因此，發(fā)現(xiàn)一種可激活SIRT6的新型藥物，對于化療副作用的臨床治療具有重要價值。
鞣花酸（Ellagic acid）是一種天然的多酚類化合物，其以游離分子或聚合物的形式廣泛存在于多種漿果中，例如樹莓、黑莓、草莓、蔓越莓、石榴、葡萄等，也存在于一些堅果和食用菌中。近年來，鞣花酸這類天然小分子受到越來越多研究者的關(guān)注，有報道稱鞣花酸對腫瘤、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病具有預(yù)防和治療作用。然而，關(guān)于鞣花酸是否能改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷仍鮮有研究證實。因此，本論文圍繞“探索鞣花酸激活SIRT6發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機制”這一目標(biāo)開展研究。
主要研究成果
1. 鞣花酸在順鉑腎毒性中的保護(hù)作用
首先在野生型C57BL/6小鼠中利用順鉑建立小鼠急性腎損傷模型，驗證鞣花酸在順鉑腎毒性中的保護(hù)作用。小鼠經(jīng)鞣花酸（50 mg/kg/day）灌胃處理7天后，再經(jīng)順鉑（20 mg/kg/day）腹腔注射3天，給藥結(jié)束后采集小鼠血液樣本和腎組織進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，順鉑處理顯著提高了小鼠腎損傷指標(biāo)血清肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）濃度（圖1A），提示順鉑處理的小鼠發(fā)生了腎功能損傷；而在順鉑處理前預(yù)先給予鞣花酸治療的小鼠則表現(xiàn)出更低的血清CREA和BUN水平（圖1A），證實了鞣花酸可有效改善順鉑所致腎損傷。
圖1 鞣花酸改善順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷
同時，H&E染色（圖1B）、TUNEL染色（圖2A）及MASSON染色（圖2B）也表明，預(yù)先給予鞣花酸治療可有效改善順鉑所引起的腎臟病理損傷、纖維化和細(xì)胞凋亡；并且，鞣花酸預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了順鉑對腎臟組織中凋亡相關(guān)因子BAX和Bcl-2的影響（圖2C）。這些結(jié)果表明，在使用順鉑前預(yù)先給予鞣花酸可作為一種改善順鉑腎毒性的有效策略。
圖2 鞣花酸緩解順鉑所致小鼠腎臟纖維化和腎細(xì)胞凋亡
2. 鞣花酸對SIRT6表達(dá)水平的調(diào)控作用
為了探究鞣花酸對順鉑腎毒性的緩解機制，采用ELISA和qPCR分別檢測小鼠血清和腎臟組織中SIRT6的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)順鉑處理后的小鼠血清和腎臟組織中SIRT6水平顯著降低，而鞣花酸預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)了順鉑導(dǎo)致的SIRT6表達(dá)下調(diào)（圖3A和3B）。同時體外實驗也顯示，鞣花酸以劑量依賴的方式升高腎臟細(xì)胞中SIRT6的mRNA和蛋白表達(dá)量（圖3C和3E），并逆轉(zhuǎn)順鉑引起的SIRT6表達(dá)水平降低（圖3D和3F）。以上結(jié)果進(jìn)一步證實了SIRT6表達(dá)上調(diào)可能是鞣花酸發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的分子機制。
圖3 鞣花酸逆轉(zhuǎn)順鉑所致SIRT6表達(dá)下降
3. 鞣花酸通過調(diào)控SIRT6減輕順鉑腎毒性
為了進(jìn)一步確定SIRT6在鞣花酸腎臟保護(hù)機制中的作用，我們在細(xì)胞水平對SIRT6進(jìn)行敲低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SIRT6敲低的腎臟細(xì)胞中，鞣花酸預(yù)處理不能緩解順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖4A）；而對照組腎臟細(xì)胞中，鞣花酸仍可有效抑制順鉑誘導(dǎo)的腎臟凋亡（圖4A）。這表明SIRT6敲低可以消除鞣花酸對腎臟細(xì)胞的保護(hù)作用，即鞣花酸的腎臟保護(hù)作用主要依賴于其對SIRT6的調(diào)控作用。
為了明確SIRT6是否是鞣花酸的直接靶標(biāo)，我們進(jìn)行了MOE-Dock模擬分析，以確定鞣花酸與SIRT6之間的結(jié)合作用。結(jié)果表明，鞣花酸與SIRT6結(jié)合位點形成了合適的空間互補，對接得分為-5.0383 kcal/mol。同時，鞣花酸與SIRT6之間可以形成氫鍵和Pi-Pi堆積相互作用，鞣花酸OH基團中的氧原子是氫鍵受體，可與SIRT6中Phe86主鏈中的氮原子形成氫鍵；而Phe86的苯環(huán)與鞣花酸的氧雜環(huán)形成Pi-Pi堆積相互作用（圖4B和4C）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了鞣花酸可以直接與SIRT6結(jié)合，通過激活SIRT6改善順鉑誘導(dǎo)的腎臟毒性。
圖4 鞣花酸通過調(diào)控SIRT6緩解順鉑腎毒性
研究結(jié)論
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸可通過與SIRT6直接結(jié)合，調(diào)控SIRT6/TNF-α信號通路，從而改善順鉑引起的腎臟病理損傷、纖維化、細(xì)胞凋亡和炎癥等多種腎臟毒性反應(yīng)。這些結(jié)果證實了鞣花酸可用于緩解順鉑治療過程中引發(fā)的腎臟毒副作用，提示鞣花酸作為一種天然多酚物質(zhì)，其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)或?qū)δ[瘤輔助治療具有重要臨床應(yīng)用價值。
清華大學(xué)藥學(xué)院王釗教授為本文通訊作者，藥學(xué)院2022屆博士畢業(yè)生高鈺琪、彭柯崢為文章共同第一作者，課題組成員王譯達(dá)、郭彥南、曾晨葉、花瑞、藥學(xué)院劉清飛副教授、醫(yī)學(xué)院高級工程師李雪博士、裘瑩副教授為本課題提供了重要幫助，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞生物學(xué)平臺的汪晶晶老師為本課題提供了重要技術(shù)支持。本研究得到國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、清華精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)基金、清華春風(fēng)基金的支持。
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213453023000952
