2023年5月4日，錢鋒教授課題組以“Polymorphic nanobody crystals as long-acting intravitreal therapy for wet age-related macular degeneration”為題在Bioengineering & Translational Medicine雜志發(fā)表研究論文，報(bào)道了一種可用于濕性AMD的新型高濃度蛋白制劑形式，為具有局部應(yīng)用需求的高濃度蛋白藥物的制劑開發(fā)與工業(yè)優(yōu)化提供了一種新的思路。
1. 研究背景
濕性AMD（wet age-related macular degeneration, wet AMD）作為老年人群體的主要致盲原因，其主要病因?yàn)榛颊咭暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（Retinal pigmented epithelium cell, RPE cell）分泌過量的血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF），促使脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層發(fā)生異常增殖，形成發(fā)育不完全的幼稚血管，進(jìn)而出現(xiàn)血漿滲漏，導(dǎo)致患者在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生重度失明。
目前針對濕性AMD的臨床治療以anti-VEGF蛋白療法為主，以玻璃體內(nèi)注射的方式給藥，注射間隔為每1-3月/次。然而，頻繁地玻璃體內(nèi)注射同樣威脅患者眼部健康。因此，延長玻璃體內(nèi)藥物注射間隔是濕性AMD蛋白藥物優(yōu)化的主要目標(biāo)。現(xiàn)有anti-VEGF蛋白藥物均以高濃度溶液形式上市，制劑優(yōu)化較為困難。尋找高濃度、高效、長效且緩釋的anti-VEGF蛋白制劑形式以滿足濕性AMD治療的臨床需求十分迫切。蛋白質(zhì)晶體混懸液因蛋白濃度高、穩(wěn)定性好、體系黏度低和潛在的緩釋性能成為高濃度蛋白制劑優(yōu)化的非常規(guī)手段。
2. 研究結(jié)果
該研究以納米抗體mNb-WT為模型蛋白藥物，根據(jù)降低蛋白表面構(gòu)象熵、減弱原有優(yōu)勢晶體不對稱單元內(nèi)部及不對稱單元之間相互作用力，和引入納米抗體類似物的策略，對mNb-WT位于表面的非功能性氨基酸進(jìn)行改造（圖1a），并通過與VEGF的結(jié)合能力（圖1b）、溶液中的聚集狀態(tài)（圖1c）、蛋白特征性二級結(jié)構(gòu)比例（圖1d,e）和AlphaFold預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)（圖1f）幾個(gè)層面，證明突變前后的納米抗體具有相似的特征，在藥學(xué)應(yīng)用中彼此具有可替代性。
圖1 mNb-WT與突變體的藥學(xué)相似性驗(yàn)證
根據(jù)上述不同策略設(shè)計(jì)的突變體納米抗體在與mNb-WT相同的結(jié)晶條件下，產(chǎn)生了性質(zhì)完全不同的晶體類型。由于上文中驗(yàn)證不同納米抗體之間在藥學(xué)應(yīng)用中彼此具有可替代性，因此，本研究中將mNb-WT及其突變體組成的不同類型晶體定義為偽多晶型晶體。晶體信息表明，mNb-WT的原始優(yōu)勢晶體為P 1晶格，招募硫酸根離子輔助納米抗體分子在晶格中排列，馬修斯常數(shù)為1.76?3/Da，對應(yīng)的晶體溶劑含量約為30%。而對納米抗體一級序列進(jìn)行改造可成功誘導(dǎo)其晶體性質(zhì)發(fā)生改變，改變納米抗體在空間中的排列方式，逐步降低晶體溶劑含量至21.92%（表1）。
表1 納米抗體偽多晶型晶體基本信息比較
通過評估納米抗體偽多晶型晶體釋放蛋白分子的速率差異，發(fā)現(xiàn)晶體釋放蛋白分子的速率與晶體晶格種類和晶體溶劑含量顯著相關(guān)（圖2a,b）。相比具有P 1晶格的晶體（mNb-WT、analogue 1和analogue 2晶體），具有P 212121晶格的晶體（mutant 2與mutant 7晶體）可顯著延緩納米抗體分子的釋放速率，具有更加優(yōu)越的緩釋性能。而當(dāng)晶體的晶格相同時(shí)，更低的晶體溶劑含量，對于延緩晶體中納米抗體分子的釋放速率具有積極的作用。通過調(diào)節(jié)mutant 7晶體外液中的鋅離子濃度，我們進(jìn)一步延緩了mutant 7晶體釋放納米抗體的速率，為蛋白晶體混懸液的產(chǎn)業(yè)優(yōu)化提供了一種新的方法（圖2c）。
圖2 納米抗體偽多晶型晶體釋放蛋白分子的速率差異
3.研究意義
綜上所述，本研究驗(yàn)證了納米抗體晶體混懸液作為新型長效緩釋的高濃度蛋白制劑用于濕性AMD治療的可行性，同時(shí)為高濃度蛋白藥物的制劑開發(fā)與性質(zhì)優(yōu)化提供了一種新的思路。
清華大學(xué)藥學(xué)院錢鋒教授和北京協(xié)和醫(yī)院陳有信教授為本文通訊作者，藥學(xué)院2023屆博士畢業(yè)生朱澍芊為本文第一作者，課題組成員唐天昕、黃成楠為本課題提供了重要幫助，清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心X-射線晶體學(xué)平臺范仕龍老師和陳喜玲老師，水木未來生物科技公司周珩博士為本課題提供了重要技術(shù)支持。本研究得到定性擇優(yōu)項(xiàng)目（清華大學(xué)-北京協(xié)和醫(yī)院合作專項(xiàng)）的支持。
原文鏈接：https://aiche.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/btm2.10523
