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2023年5月9日，清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏團(tuán)隊(duì)、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤團(tuán)隊(duì)與清華大學(xué)生命學(xué)院李丕龍團(tuán)隊(duì)聯(lián)合，在Cell Discovery雜志在線發(fā)表了題為“BRD4-targeting PROTAC as a unique tool to study biomolecular condensates”的研究性論文。在這項(xiàng)研究中，作者利用PROTAC高效、快速、可逆、動(dòng)態(tài)降解靶蛋白的特性，通過(guò)降解BRD4探究其相關(guān)生物大分子凝聚物形成特征，聯(lián)用免疫熒光染色和高通量測(cè)序?qū)ROTAC誘導(dǎo)的靶蛋白分相形態(tài)和功能的改變進(jìn)行監(jiān)測(cè)，揭示該過(guò)程中BRD4與其他組分凝聚物的功能伴隨，這是PROTAC在LLPS研究中的首次運(yùn)用，為解決領(lǐng)域內(nèi)關(guān)鍵問(wèn)題提供了新方法和新見(jiàn)解。

研究背景

PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimeras)技術(shù)是近年來(lái)蓬勃發(fā)展的新興蛋白質(zhì)降解策略。PROTAC的基本原理是使用雙功能小分子，通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)誘導(dǎo)靶蛋白的泛素化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)靶蛋白降解。自2019年第一個(gè)靶向雄激素受體PROTAC分子ARV-110進(jìn)入臨床研究以來(lái)，PROTAC領(lǐng)域進(jìn)入快速發(fā)展期。

液液相分離 (liquid-liquid phase separation, LLPS)是生物大分子在真核細(xì)胞中聚集形成無(wú)膜細(xì)胞器的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞區(qū)域化的重要機(jī)制，展現(xiàn)了真核細(xì)胞對(duì)各種生理活動(dòng)的精準(zhǔn)、動(dòng)態(tài)的時(shí)空調(diào)控。當(dāng)前，如何建立相分離現(xiàn)象和生物學(xué)功能之間的關(guān)系是該領(lǐng)域內(nèi)的重要科學(xué)問(wèn)題。相分離對(duì)系統(tǒng)計(jì)量高度依賴(lài)，各組分形成分相的臨界濃度尤為關(guān)鍵，因此需要高效、快速、動(dòng)態(tài)的擾動(dòng)技術(shù)的支持。此外，如何避免體外實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能、探究生理?xiàng)l件下的相分離狀態(tài)、剖析分相液滴中支架蛋白與乘客蛋白身份和功能的轉(zhuǎn)換及其內(nèi)在分子機(jī)制等問(wèn)題都迫切需要新技術(shù)和新方法的建立。現(xiàn)有技術(shù)手段如CRISPR-Cas9/RNA干擾（RNAi）等遺傳學(xué)工具在體內(nèi)直接研究相分離面臨很多挑戰(zhàn)。基因編輯技術(shù)對(duì)DNA修改具有不可逆的特點(diǎn)，難以獲得編碼蛋白質(zhì)的中間狀態(tài)。RNAi技術(shù)由于起效時(shí)間長(zhǎng)，在體內(nèi)快速動(dòng)態(tài)的相變化過(guò)程中，RNAi不足以作為一個(gè)強(qiáng)有力的研究工具。小分子抑制劑雖然能夠影響相分離的形成，但其多作用于底物結(jié)合位點(diǎn)，而相分離常由蛋白質(zhì)其他的如骨架功能誘導(dǎo)，會(huì)導(dǎo)致研究不夠充分，同時(shí)小分子抑制劑發(fā)揮其功能往往會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白上調(diào)反饋，需要更高的作用劑量。相分離領(lǐng)域仍然缺乏在野生型細(xì)胞系上直接干擾LLPS的高效方法。

研究結(jié)果

首先，通過(guò)PROTAC、免疫熒光染色、定量計(jì)算等技術(shù)的聯(lián)用，研究者們建立了靶向細(xì)胞內(nèi)BRD4凝聚物的“PROTAC-target protein-LLPS”研究方法。研究者們使用100 nM的ZXH-3-26在HeLa細(xì)胞中測(cè)定內(nèi)源的BRD4降解動(dòng)力學(xué)。他們發(fā)現(xiàn)，靶向BRD4的PROTAC分子（ZXH-3-26）能夠在低濃度、短時(shí)間內(nèi)快速降解BRD4及其凝聚物（圖1）。BRD4-PROTACs處理細(xì)胞30分鐘后即可觀察到BRD4蛋白水平顯著降低，4小時(shí)后BRD4蛋白完全降解，同時(shí)BRD4凝聚物數(shù)量也急劇減少。這說(shuō)明PROTAC能夠作為一個(gè)快速擾動(dòng)凝聚物組分的工具。

圖1. “PROTAC-target protein-LLPS”研究方法的建立

隨后，研究者們利用PROTAC的可逆性進(jìn)一步探究該技術(shù)運(yùn)用于LLPS研究的潛力。有趣的是，他們通過(guò)Wash-out實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去除BRD4-PROTACs后24 小時(shí)，內(nèi)源的BRD4凝聚物數(shù)量已幾乎恢復(fù)到原始水平，而此時(shí)BRD4的蛋白水平才剛剛開(kāi)始出現(xiàn)恢復(fù)跡象（圖2）。即BRD4相關(guān)凝聚物的恢復(fù)可能優(yōu)先于BRD4蛋白水平的恢復(fù)，這是PROTAC應(yīng)用于LLPS研究首次發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。

圖2. BRD4-PROTACs的可逆性助力LLPS研究

針對(duì)以上有趣的現(xiàn)象，研究者們進(jìn)一步開(kāi)展多組學(xué)分析闡釋其可能的生理功能意義。通過(guò)RNA-seq和Cut&Tag-seq探討對(duì)照組、BRD4-PROTACs處理后6小時(shí)、wash-out 18小時(shí)、wash-out 42小時(shí)的基因表達(dá)譜，以及BRD4在TSS區(qū)、enhancer區(qū)和super-enhancer區(qū)的定位變化。數(shù)據(jù)顯示， wash-out 42小時(shí)組的基因表達(dá)情況已經(jīng)恢復(fù)到與對(duì)照組接近。更令人意外的是，隨著降解劑的去除，BRD4在短時(shí)間內(nèi)迅速恢復(fù)并更偏好占據(jù)在super-enhancer區(qū)，尤其是一些關(guān)鍵癌基因和細(xì)胞周期基因的super-enhancer區(qū) （圖3）。這一結(jié)果說(shuō)明PROTAC可以成為研究生物大分子凝聚物的生理病理功能的一種強(qiáng)有力工具，它的降解快速且可逆是其作為L(zhǎng)LPS研究工具的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。

圖3. BRD4-PROTAC降解及Wash-out實(shí)驗(yàn)引起細(xì)胞基因組和染色質(zhì)狀態(tài)變化

生物大分子凝聚物中各組分的多價(jià)態(tài)相互作用是LLPS的基礎(chǔ)，剖析其中關(guān)鍵組分蛋白之間的物理及功能交互是LLPS領(lǐng)域內(nèi)的關(guān)鍵問(wèn)題。于是研究者們基于BRD4-PROTACs探討B(tài)RD4相關(guān)凝聚物中其他重要組分（MED1/CYCT1/p300）的分相變化。研究者發(fā)現(xiàn)，在BRD4-PROTACs的作用下，內(nèi)源的MED1和CYCT1凝聚物在6小時(shí)內(nèi)顯著減少， 12 小時(shí)又恢復(fù)到與對(duì)照組幾近相同的水平。而p300作為BRD4的上游分子，其凝聚物不受干擾（圖4）。另外，他們首次發(fā)現(xiàn)隨著B(niǎo)RD4降解，BRD3在MED1和CYCT1凝聚物的恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了代償功能。靶向BRD4的PROTACs不僅為研究BRD4相分離提供了一種新的有效工具，而且為剖析BRD4相分離的分子機(jī)制和動(dòng)力學(xué)提供了一種新的策略。

圖4. 通過(guò)BRD4-PROTACs探究MED1/CYCT1/p300/BRD3在BRD4相分離中的關(guān)鍵功能

研究意義

總之，在該工作中，研究者首次建立了“PROTAC-target protein-LLPS”的研究方法，以期從多維度探究LLPS相關(guān)的內(nèi)源蛋白-蛋白相互作用、蛋白時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控的精密機(jī)制。在LLPS研究中，基于PROTAC的研究方法快速、高效、可逆，優(yōu)于傳統(tǒng)遺傳學(xué)工具對(duì)靶基因的擾動(dòng)；同時(shí)，相較于常用解聚凝聚體的小分子（如1,6-己二醇），PROTAC也更具有特異性和靶向性。另外，將此方法與多組學(xué)手段聯(lián)合分析，不僅能夠探究凝聚物中各組分之間的互作和功能伴隨，而且將為相分離與生物功能之間建立因果關(guān)系提供可能。值得一提的是，PROTAC技術(shù)被譽(yù)為助力小分子藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)入“新黃金時(shí)代”的技術(shù)， PROTAC有望在相分離異常導(dǎo)致的疾病治療中發(fā)揮其重要作用。

圖5. BRD4-PROTACs工作模型示意圖

饒燏團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)的開(kāi)發(fā)工作，致力于發(fā)展新型降解技術(shù)及其應(yīng)用，已取得了系列研究成果：提出了 PROTAC 和分子膠協(xié)同應(yīng)用的模式。首次設(shè)計(jì)合成了新型雙靶、雙機(jī)制的降解劑，為靶向降解技術(shù)的發(fā)展提出了新的思路（Cell Research 2021）；實(shí)現(xiàn)難成藥靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)，設(shè)計(jì)合成全球首例選擇性CDK2降解劑，實(shí)現(xiàn)AML高效且低毒的分化治療（Nature Chemical Biology 2021）；構(gòu)建高效的BTK降解劑，解決臨床中出現(xiàn)的Ibrutinib耐藥問(wèn)題（Cell Research 2018；Leukemia 2019）;構(gòu)建PROTACs系統(tǒng)性敲除模型，快速可逆實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)蛋白敲除（Cell Discovery 2019）；構(gòu)建新型CDK4/6降解劑，有效抑制腫瘤增殖（Journal of Medicinal Chemistry 2019）；此次研究也是該團(tuán)隊(duì)拓展新型靶向蛋白降解技術(shù)與生物學(xué)新興前沿-相分離領(lǐng)域的交叉探索。

清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏課題組2020級(jí)博士生施奕（CLS項(xiàng)目）、醫(yī)學(xué)院李海濤課題組2020級(jí)博士生廖源（PTN項(xiàng)目）為該論文共同第一作者，清華大學(xué)藥學(xué)院博士生劉乾隆，博士生倪智豪以及醫(yī)學(xué)院博士生張真真參與了該工作，清華大學(xué)李丕龍教授、李海濤教授和饒燏教授為共同通訊作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院師明磊研究員為本論文提供了寶貴建議和指導(dǎo)。該研究得到了清華大學(xué)吳畏教授、鄧海騰教授和曾堅(jiān)陽(yáng)教授的幫助，并得到了清華大學(xué)細(xì)胞影像中心以及尼康影像中心的技術(shù)支持。該研究得到了中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的大力支持。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-023-00544-0