近期，清華大學(xué)藥學(xué)院劉剛教授課題組在美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志Analytical Chemistry發(fā)表了新型結(jié)核分枝桿菌單細(xì)胞熒光診斷試劑的研究結(jié)果，題目：From Bench to Clinic: A Nitroreductase Rv3368c-Responsive Cyanine-Based Probe for the Specific Detection of Live Mycobacterium Tuberculosis，已于2024年1月8日上線（https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04293）。該項(xiàng)研究由洪小巧博士生、耿鵬飛博士生和北京胸科醫(yī)院田娜博士生等共同完成，并得到了首都醫(yī)科大學(xué)北京胸科醫(yī)院孫照剛博士的支持。

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) 引起的傳染病，其特點(diǎn)是死亡率高，低診斷率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，2021年，全球預(yù)計(jì)有1060萬(wàn)人患上結(jié)核病，但僅有640萬(wàn)人被確診為結(jié)核病，結(jié)核病的診斷是結(jié)核防疫中最薄弱的一環(huán)。使用auramine O (AO) 或Ziehl-Nielsen痰涂片鏡檢是結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家的一線診斷方法，然而，AO和Ziehl-Nielsen都與Mtb細(xì)胞壁中的分枝菌酸結(jié)合，不能區(qū)分活菌和死菌，不能反映結(jié)核病患者服藥后的治療效果，容易導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生。此外，AO的染色步驟繁瑣，易受臨床樣本中的食物殘?jiān)㈦s蛋白等自發(fā)熒光干擾、抗淬滅能力差，臨床迫切需要開發(fā)新一代光穩(wěn)定性強(qiáng)的熒光探針，用于快速、簡(jiǎn)便地標(biāo)記Mtb。由于臨床痰液樣本中存在不同的菌種和復(fù)雜的成分，對(duì)熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、光學(xué)穩(wěn)定性、特異性以及樣本處理穩(wěn)定性等多方面均有較高的要求，雖然目前已報(bào)道了多種Mtb新型熒光探針，但多停留在實(shí)驗(yàn)室水平。

本研究設(shè)計(jì)合成了一系列的花菁類熒光探針，并確定熒光強(qiáng)度最高的Cy3-NO₂-tre為最終熒光試劑。Cy3-NO₂-tre自身不發(fā)光，但在細(xì)菌內(nèi)可被特異的硝基還原酶Rv3368c還原后開啟熒光。Cy3-NO₂-tre可以選擇性標(biāo)記不同種屬混合菌中的Mtb，而不會(huì)對(duì)其他的細(xì)菌產(chǎn)生熒光標(biāo)記 (圖1)。課題組采用Pull down 實(shí)驗(yàn)技術(shù)鑒定了Cy3-NO₂-tre作用靶點(diǎn)—Rv3368c，并通過(guò)比較Cy3-NO₂-tre在Rv3368c基因敲除、回補(bǔ)分枝桿菌菌株內(nèi)、過(guò)表達(dá)Rv3368c大腸桿菌DE3的熒光強(qiáng)度得到驗(yàn)證 (圖2)。基于NCBI的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，Rv3368c主要表達(dá)于結(jié)核分枝桿菌科。

圖1.花菁熒光探針的結(jié)構(gòu)與熒光標(biāo)記能力。

圖2. 特異性硝基還原酶RV3368c的探究與驗(yàn)證。

Cy3-NO₂-tre可以選擇性標(biāo)記宿主細(xì)胞內(nèi)的Mtb，而不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生非特異性標(biāo)記 (圖3)。Cy3-NO₂-tre響應(yīng)較快、免清洗和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)使其能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)Mtb感染宿主細(xì)胞的全過(guò)程。課題組利用Cy3-NO₂-tre成功地觀察到宿主細(xì)胞伸出偽足捕獲Mtb的過(guò)程，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌能夠成功逃脫宿主細(xì)胞偽足的“抓捕”，為進(jìn)一步研究宿主細(xì)胞和Mtb的相互作用提供了工具分子。

圖3. Cy3-NO₂-tre跟蹤Mtb與宿主細(xì)胞的相互作用

課題組采用Cy3-NO₂-tre檢測(cè)了臨床痰液樣本中的活Mtb。與AO相比，Cy3-NO₂-tre表現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的熒光抗淬滅能力 (圖4)。基于Cy3-NO₂-tre只標(biāo)記活菌的特性，課題組將其與AO聯(lián)用，初步研究了監(jiān)測(cè)結(jié)核患者的抗結(jié)核藥物的治療效果。通常，結(jié)核患者需要服藥三個(gè)月后再通過(guò)CT復(fù)查判斷該患者對(duì)治療方案的敏感性。采用Cy3-NO₂-tre監(jiān)測(cè)患者藥物治療前與治療一周后痰液中活/死菌比例的變化，初步研究了患者服藥治療3個(gè)月后的CT結(jié)果相關(guān)性(圖5)，表明Cy3-NO₂-tre有可能能夠用于早期監(jiān)測(cè)抗結(jié)核藥物的治療效果，大規(guī)模的臨床樣本研究正在進(jìn)行中。

圖4. Cy3-NO₂-tre在臨床痰液樣本上的熒光抗淬滅效果強(qiáng)于AO。

圖5. Cy3-NO₂-tre用于早期評(píng)價(jià)結(jié)核病患者的抗結(jié)核治療效果。