清華大學(xué)藥學(xué)院李寅青課題組及其合作者于2024年7月2日在 Nature Biotechnology 期刊上發(fā)表了題為Tracking-seq reveals the heterogeneity of off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome editing的研究論文，報道了一項名為Tracking-seq的新型脫靶效應(yīng)檢測技術(shù)，并借助該技術(shù)揭示了不同細(xì)胞類型、不同編輯工具間存在的脫靶效應(yīng)異質(zhì)性。此項研究將為基因編輯在基因治療等領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供重要理論參考及技術(shù)支持。

近年來，隨著諸如胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor, CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor, ABE）和先導(dǎo)編輯器 （prime editor, PE）等新型基因編輯工具不斷被開發(fā)，CRISPR/Cas系統(tǒng)引領(lǐng)的基因編輯技術(shù)在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。然而，脫靶效應(yīng)——即在預(yù)期目標(biāo)之外產(chǎn)生的編輯——不僅影響了生物學(xué)研究的準(zhǔn)確性，也給基因治療的臨床應(yīng)用帶來了潛在的安全隱患。2023年美國食品藥品監(jiān)督管理局在審查首個CRISPR基因編輯療法的上市申請時，風(fēng)險評估，尤其是脫靶效應(yīng)是其關(guān)注焦點。高效且精準(zhǔn)地檢測脫靶效應(yīng)成為了基因編輯技術(shù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。

為應(yīng)對脫靶挑戰(zhàn)，科學(xué)界提出了多種檢測方法，包括基于生物信息學(xué)的預(yù)測、生物化學(xué)檢測和細(xì)胞水平檢測方法。然而現(xiàn)存方法普適性較低，或僅針對有限的編輯系統(tǒng)或細(xì)胞類型設(shè)計，并且大多數(shù)方法無法應(yīng)用于離體及體內(nèi)編輯時的脫靶檢測。

目前的主流基因編輯器均依賴于DNA損傷后的修復(fù)過程實現(xiàn)基因編輯，復(fù)制蛋白A（replication protein A, RPA）廣泛存在于基因組雙鏈及單鏈損傷修復(fù)過程，Tracking-seq通過CUT&RUN技術(shù)特異性地識別并捕獲與RPA結(jié)合的單鏈DNA（Single-stranded DNA, ssDNA），隨后利用鏈特異性核酸酶消化雙鏈DNA以提高信噪比，構(gòu)建鏈特異性ssDNA文庫進(jìn)行高通量測序，并通過新開發(fā)的算法精確計算RPA信號強(qiáng)度，進(jìn)而實現(xiàn)對多種編輯工具的脫靶檢測。

圖1. Tracking-seq示意圖

相較于現(xiàn)有的GUIDE-seq和DISCOVER-seq等脫靶檢測技術(shù)，Tracking-seq不僅展現(xiàn)了高召回率，而且具備很高的檢測精確度。重要的事，其具有高度的泛用性，使其能夠適用于Cas9、CBE、ABE以及PE等各類主流基因編輯工具，并能適應(yīng)不同的細(xì)胞類型及不同的編輯環(huán)境（包括體外、離體及體內(nèi)編輯）。此外，Tracking-seq的高靈敏度使其能夠在僅有數(shù)千個細(xì)胞的樣品中，有效地進(jìn)行脫靶檢測，并保持優(yōu)異的結(jié)果。

圖2. Tracking-seq檢測不同編輯工具的鏈特異性信號

得益于Tracking-seq的高泛用性，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用相同的向?qū)NA時，Cas9、CBE、ABE和PE的脫靶效應(yīng)存在明顯差異，其中Cas9和CBE之間觀測到了許多近似于各自特異的脫靶位點。此外，不同類型的細(xì)胞中也觀察到了脫靶效應(yīng)的異質(zhì)性，脫靶事件似乎更容易在染色質(zhì)開放和活躍的區(qū)域發(fā)生。這些脫靶效應(yīng)的異質(zhì)性提示，使用替代性編輯系統(tǒng)或在不同細(xì)胞類型中進(jìn)行的脫靶檢測，可能無法準(zhǔn)確反映目標(biāo)細(xì)胞中實際的脫靶情況。相比之下，Tracking-seq技術(shù)能夠直接對原始編輯系統(tǒng)進(jìn)行脫靶檢測，因此具有廣闊的應(yīng)用潛力和前景。