PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera）是一種通過(guò)雙功能小分子誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白泛素化并實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白降解的的新型蛋白降解技術(shù)。此技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)多種藥物靶點(diǎn)的降解，包括激酶、受體等，也已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，包括腫瘤、病毒感染、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病等。PROTAC事件驅(qū)動(dòng)的作用模式使其對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要求降低，理論上可以實(shí)現(xiàn)缺乏有效配體的難成藥靶點(diǎn)降解劑開(kāi)發(fā)。但遺憾的是，目前針對(duì)難成藥靶點(diǎn)降解劑的開(kāi)發(fā)仍然較少。

E3連接酶是細(xì)胞內(nèi)催化蛋白質(zhì)泛素化修飾的關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中具有廣泛而重要的功能，其異常表達(dá)或功能失調(diào)與多種疾病（包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病和免疫疾病）。但由于E3連接酶有六百多種，每種酶都有其特定的底物，這種多樣性使得開(kāi)發(fā)能夠特異性靶向單一E3連接酶的藥物變得非常困難。同時(shí)E3連接酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域和亞基，且這些結(jié)構(gòu)域在蛋白-蛋白相互作用中起關(guān)鍵作用，傳統(tǒng)小分子抑制劑難以同時(shí)靶向所有結(jié)構(gòu)域和亞基，不能完全阻斷E3連接酶的功能。最后，由于E3連接酶的活性位點(diǎn)往往較寬且與底物結(jié)合較松散，因此難以用傳統(tǒng)小分子藥物實(shí)現(xiàn)E3連接酶的功能擾動(dòng)。因此，E3連接酶作為一類難成藥靶點(diǎn)，需要新的開(kāi)發(fā)技術(shù)和策略實(shí)現(xiàn)其藥物開(kāi)發(fā)。

Smurf1（Smad ubiquitination regulatory factor 1）是一種HECT（Homologous to the E6AP Carboxyl Terminus）型E3泛素連接酶，參與多種生理過(guò)程，如1）通過(guò)與Smad蛋白相互作用，促進(jìn)Smad1和Smad5等Smad蛋白的泛素化和降解，負(fù)反饋調(diào)控TGF-β信號(hào)通路的活性；2）通過(guò)降解某些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，如RhoA，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，影響細(xì)胞增殖；3）通過(guò)泛素化降解Runx2（骨形成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）或者調(diào)控BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）信號(hào)通路，影響骨形成和重塑。Smurf1已成為藥物開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)，但E3泛素連接酶作為一種代表性的難成藥靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)針對(duì)Smurf1的選擇性小分子抑制劑一直充滿挑戰(zhàn)。

2024年7月22日，清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏團(tuán)隊(duì)與國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）張令強(qiáng)、崔春萍及南方醫(yī)科大學(xué)Zhang Xueli 團(tuán)隊(duì)合作在《Nature Chemical Biology》上發(fā)表了題為“Targeting Smurf1 to block PDK1–Akt signaling in KRAS-mutated colorectal cancer”的研究文章。在這項(xiàng)研究中，作者揭示了Smurf1介導(dǎo)的磷酸肌苷依賴性蛋白激酶1(PDK1)類化修飾在PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤發(fā)生中的重要作用，并利用新的PROTAC開(kāi)發(fā)策略獲得了具有獨(dú)特配體的高效Smurf1的降解劑。這種開(kāi)發(fā)策略為難成藥靶點(diǎn)的降解劑開(kāi)發(fā)提供了創(chuàng)新思路。

首先，作者發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)因子刺激下，Smurf1立即觸發(fā)PDK1類化修飾，多神經(jīng)前細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)的蛋白8 (poly-Nedd8)鏈募集甲基轉(zhuǎn)移酶SET結(jié)構(gòu)域分叉組蛋白lysine甲基轉(zhuǎn)移酶1(SETDB1)。PDK1胞質(zhì)復(fù)合體與Smurf1和SETDB1組裝(cCOMPASS)，由PDK1、Smurf1和SETDB1組成，指導(dǎo)Akt膜附著和T308磷酸化。在遺傳小鼠模型中，Smurf1缺陷顯著降低CRC腫瘤發(fā)生。

隨后，作者利用藥物發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)和生物活性片段作為基本單元，通過(guò)不同類型的連接鏈和E3泛素連接酶配體，構(gòu)建了一個(gè)結(jié)構(gòu)多樣性的PROTAC庫(kù)。這種策略極大地?cái)U(kuò)展了化合物在化學(xué)空間中的分布。利用HiBiT高通量篩選技術(shù)，快速獲得Smurf1苗頭降解劑。經(jīng)過(guò)多輪篩選和結(jié)構(gòu)優(yōu)化（從大規(guī)模到小規(guī)模庫(kù)），最終開(kāi)發(fā)出了具有獨(dú)特配體的高效Smurf1降解劑SMART1，成功克服了這一難成藥靶點(diǎn)的挑戰(zhàn)（圖1a）。

圖1. Smurf1降解劑分子SMART1 的開(kāi)發(fā)及評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SMART1能夠與Smurf1的HECT域結(jié)合（KD = 500 nM），而不與Smurf2結(jié)合（圖2a-d）。在HCT116細(xì)胞中，SMART1可以依時(shí)間和劑量遞增的方式誘導(dǎo)Smurf1降解（DC50 = 1~5 nM，Dmax為86%）（圖1b）。當(dāng)存在CRBN或Smurf1配體時(shí)，SMART1誘導(dǎo)的Smurf1降解會(huì)受到阻礙（圖2g），這表明SMART1通過(guò)與Smurf1和CRBN結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)其降解作用。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移和共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)也顯示SMART1能有效與Smurf1和CRBN形成三元復(fù)合物，且在高達(dá)10μM時(shí)，PROTAC降解劑的“Hook效應(yīng)”并不明顯（圖1c，2h）。與野生型Smurf1相比，Smurf1的Y439A突變體與SMART1之間的相互作用顯著減弱，并且SMART1無(wú)法有效降解該突變體；同時(shí)，CRBN的缺失削弱了SMART1的作用（圖2i-k）。預(yù)處理蛋白酶體抑制劑MG132或Nedd8 E1抑制劑MLN4924可以阻斷Smurf1的降解。不同于泊馬度胺或Smurf1配體，SMART1增加了細(xì)胞中Smurf1的泛素化，表明其作用依賴于蛋白酶體機(jī)制和cullin–RING泛素化級(jí)聯(lián)（圖2l）。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)了Smurf1的顯著下調(diào)，彰顯了SMART1的高選擇性（圖1d）。在小鼠異種移植瘤模型中，SMART1顯示出強(qiáng)大的體內(nèi)腫瘤抑制效果，同時(shí)具有較低的毒性，表現(xiàn)為動(dòng)物體重?zé)o顯著變化，重要器官的組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常（圖1e-1h）。此外，作者分析了其他含HECT結(jié)構(gòu)域的連接酶、U3 snoRNA結(jié)合蛋白（U3 snoRNA結(jié)合蛋白R(shí)RP9是唯一已知的由Smurf1催化的Nedd8底物）或已報(bào)道的CRBN配體的脫靶蛋白在豐度上均未有顯著變化（圖2m, n）。這些數(shù)據(jù)均表明，SMART1是一種高效、高選擇性的新型Smurf1蛋白降解劑。

圖2. SMART1通過(guò)直接結(jié)合Smurf1誘導(dǎo)其依賴于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的選擇性降解。

綜上，本研究通過(guò)揭示類泛素化修飾在PDK1激活中的未被探索的作用，闡明了E3連接酶 Smurf1是KRAS突變型結(jié)直腸癌的藥物靶標(biāo)。針對(duì)難成藥靶點(diǎn)Smurf1，本研究基于成藥片段結(jié)構(gòu)和生物活性片段，構(gòu)建了覆蓋廣泛化學(xué)空間的降解劑庫(kù)；通過(guò)應(yīng)用HiBiT高通量篩選，快速成功開(kāi)發(fā)了一種具有獨(dú)特創(chuàng)新靶蛋白配體的降解劑，降解劑在體內(nèi)外表現(xiàn)出強(qiáng)大的腫瘤抑制作用，在免疫能力強(qiáng)的小鼠中耐受性良好。這種高效且高選擇性的Smurf1蛋白降解劑為KRAS突變的結(jié)直腸癌治療提供了潛在的治療藥物和策略，同時(shí)為難成藥靶點(diǎn)的降解劑開(kāi)發(fā)提供了新思路。

饒燏團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)的開(kāi)發(fā)工作，致力于發(fā)展新型降解技術(shù)及其應(yīng)用，已取得了一系列研究成果：發(fā)展基于降解的蛋白質(zhì)分析（Degradation-Based Protein Profiling，DBPP），并將其應(yīng)用于中藥活性成分的靶點(diǎn)鑒定（Advanced Science 2024）；將PROTAC首次應(yīng)用于相分離，建立了基于PROTAC的BRD4相分離研究新方法（Cell Discovery 2023）；提出了 PROTAC 和分子膠協(xié)同應(yīng)用的模式，首次設(shè)計(jì)合成了新型雙靶、雙機(jī)制的降解劑，為靶向降解技術(shù)的發(fā)展提出了新的思路（Cell Research 2021）；實(shí)現(xiàn)難成藥靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)，設(shè)計(jì)合成全球首例選擇性CDK2降解劑，實(shí)現(xiàn)AML高效且低毒的分化治療（Nature Chemical Biology 2021）；構(gòu)建高效的BTK降解劑，解決臨床中出現(xiàn)的Ibrutinib耐藥問(wèn)題（Cell Research 2018；Leukemia 2019）;構(gòu)建PROTAC系統(tǒng)性敲除模型，快速可逆實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)蛋白敲除（Cell Discovery 2019）；構(gòu)建新型CDK4/6降解劑，有效抑制腫瘤增殖（Journal of Medicinal Chemistry 2019）。此次研究也是該團(tuán)隊(duì)拓展PROTAC在難成藥靶點(diǎn)方面的應(yīng)用。