2024年9月26日，清華大學(xué)藥學(xué)院秦為課題組、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院王初課題組和陳興課題組聯(lián)合在Angewandte Chemie International Edition雜志上發(fā)表了題為 “Chemical recording of pump-specific drug efflux in living cells” 的研究論文。該研究開發(fā)了一種化學(xué)生物學(xué)新技術(shù)BRIEF，利用化學(xué)探針在活細(xì)胞中記錄特定外排泵的藥物外排過程，為理解藥物耐藥性提供了新的視角。
研究背景
耐藥性在臨床藥物實(shí)踐中至關(guān)重要，它直接影響治療效果和患者預(yù)后。在細(xì)胞膜上存在著大量的外排泵通道蛋白，介導(dǎo)著外源藥物的排出。這些外排泵在癌細(xì)胞中過表達(dá)，造成了很多抗癌藥物的耐藥性。例如，近年來新興的蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）也會被外排泵排出，從而降低其胞內(nèi)濃度和藥效，為其臨床應(yīng)用帶來了較大挑戰(zhàn)。抑制外排泵可以提高對應(yīng)藥物的胞內(nèi)水平和療效，因此外排泵抑制劑與抗癌藥物聯(lián)合使用成為一種很有前景的化療策略。
ATP 結(jié)合盒式蛋白(ABC)家族包含多種外排泵，它們介導(dǎo)了多種藥物的耐藥性。比較常見的如P-糖蛋白（P-gp或ABCB1）會阻礙藥物的細(xì)胞攝取，或多藥耐藥蛋白家族（MRPs或ABCC）會外排不同結(jié)構(gòu)特征的多種藥物。鑒定某種藥物具體由哪些外排泵所排出至關(guān)重要，但卻充滿挑戰(zhàn)。主要原因是不同外排泵的底物數(shù)量眾多且結(jié)構(gòu)迥異，例如MRP1 (ABCC1)可以泵出數(shù)百種不同結(jié)構(gòu)的藥物，包括抗癌藥物長春花堿和重金屬陰離子；同時一些藥物可能是多個泵的底物，如黃芩苷，它同時由MRP3和MRP4運(yùn)輸。這使得通過結(jié)構(gòu)預(yù)測來判斷藥物是否為特定外排泵的底物十分困難，同時也缺乏高通量篩選手段在活細(xì)胞中鑒定可被特定外排泵排出的小分子藥物。
研究內(nèi)容
針對以上問題，本文開發(fā)了一種生物正交報告抑制外排(bioorthogonal reporter inhibiting efflux，BRIEF)系統(tǒng)，用于評估活細(xì)胞中具有泵特異性的藥物外排。BRIEF中使用的生物正交外排探針(BEP)包含三個關(guān)鍵要素(圖1a)：
(i) 靶向特定外排泵的特異性底物支架，保障BEP的外排泵選擇性
(ii) 對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價標(biāo)記的反應(yīng)元件
(iii) 可通過點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行熒光檢測的檢測元件
在BRIEF實(shí)驗(yàn)中，如果待檢測藥物和BEP通過了相同外排泵，會產(chǎn)生競爭效應(yīng)導(dǎo)致BEP外排減少，從而增加BEP的胞內(nèi)濃度及其蛋白質(zhì)標(biāo)記強(qiáng)度(圖1b)。通過對細(xì)胞裂解物進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)熒光基團(tuán)，可通過膠內(nèi)熒光檢測判斷細(xì)胞內(nèi)BEP水平(圖1c)。基于此，BRIEF技術(shù)將瞬時動態(tài)的外排過程記錄為穩(wěn)定、可累積的化學(xué)標(biāo)記信號，便于后續(xù)檢測。
圖1. BRIEF的工作原理
為了驗(yàn)證BRIEF的可行性，首先需要發(fā)展特異的BEP探針。作者首先關(guān)注到了全乙酰化非天然糖探針（如Ac4GlcNAl），這類探針被廣泛應(yīng)用于糖質(zhì)代謝標(biāo)記研究糖基化的生物學(xué)功能。乙酰化保護(hù)顯著提高了非天然糖探針的疏水性和細(xì)胞膜通透性，但近年來也發(fā)現(xiàn)乙酰化保護(hù)造成了非天然糖探針與半胱氨酸的副反應(yīng)。由于此類疏水探針可能是外排泵的潛在底物，同時又具有特異的胞內(nèi)蛋白反應(yīng)活性，作者首先探究了全乙酰化非天然糖探針成為BEP的潛力。以Ac4GlcNAl探針為例，作者利用不同泵的抑制劑共處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ABCC家族的抑制劑MK-571顯著提高了Ac4GlcNAl的標(biāo)記信號（圖2a）。這表明Ac4GlcNAl主要通過ABCC亞家族排出，因此作者分別敲低了ABCC的不同外排泵，發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)其外排的外排泵為ABCC3，4，10和12，因此Ac4GlcNAl可以作為這些外排泵的BEP探針。作者隨后選擇了此類外排泵的已知底物黃芩苷來測試其對Ac4GlcNAl的外排競爭效果。結(jié)果顯示在不同的細(xì)胞系中，黃芩苷處理都會增加Ac4GlcNAl的標(biāo)記強(qiáng)度（圖2b）。作者隨后篩選了其它黃酮類化合物，作者發(fā)現(xiàn)槲皮素、芹菜素和黃芩素也都是潛在的ABCC底物（圖2c）。
圖2. 基于非天然糖探針的BRIEF策略驗(yàn)證
作者進(jìn)一步基于BRIEF建立小分子藥物的外排篩選平臺，對409種天然產(chǎn)物的外排情況進(jìn)行了篩選鑒定(圖3a)， 從而發(fā)現(xiàn)了單寧酸、沒食子酸和膽固醇這三種天然小分子可以由ABCC外排泵所排出（圖3b）。其中單寧酸對Ac4GlcNAl標(biāo)記信號的提高最為明顯，因此作者進(jìn)一步驗(yàn)證了ABCC的抑制劑是否可以增強(qiáng)單寧酸的藥用活性。單寧酸已知具有抑制癌細(xì)胞增值和抗SARS-COV-2的活性，作者發(fā)現(xiàn)結(jié)合ABCC抑制劑MK-571處理，可以顯著提高單寧酸的抑癌活性（圖3c）和抗SARS-COV-2的活性（圖3d）。
圖3. ABCC外排泵的藥物外排篩選
作者最后驗(yàn)證了BRIEF策略的普適性，發(fā)展了針對P-gp（ABCB1）外排泵的BEP探針。羅丹明123已知可以被ABCB1外排，同時它具有光催化鄰近標(biāo)記的反應(yīng)活性。作者因此選用羅丹明123作為ABCB1的BEP探針（圖4），并同樣進(jìn)行了活細(xì)胞內(nèi)的底物篩選，發(fā)現(xiàn)了二氫茉莉酸甲酯作為新的P-gp底物，證明了BRIEF策略的普適性。綜上所述，BRIEF方法提供了一個通用的、可擴(kuò)展的活細(xì)胞篩選平臺，通過對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的化學(xué)標(biāo)記來監(jiān)測藥物外排情況。
圖4. 基于光催化鄰近標(biāo)記的BRIEF策略檢測P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排
致謝
清華大學(xué)藥學(xué)院秦為助理教授、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院王初教授、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院陳興教授為本文的共同通訊作者。清華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院丁強(qiáng)副教授為本文提供了重要實(shí)驗(yàn)幫助。清華大學(xué)藥學(xué)院博士生孫雪歌、北京大學(xué)博士畢業(yè)生陳影（現(xiàn)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所助理教授）為本文的共同第一作者。清華大學(xué)博士生楊晨，博士后潘宣圳，北京大學(xué)博士畢業(yè)生楊嵩，林瑋（現(xiàn)為加州大學(xué)圣迭戈分校博士后），全柏嶧（現(xiàn)為加州理工大學(xué)Staff Scientist）為本文提供了重要實(shí)驗(yàn)幫助。清華大學(xué)劉剛課題組提供了細(xì)胞系和小分子藥物支持。清華大學(xué)藥學(xué)院活性篩選平臺提供了篩選技術(shù)支持。秦為課題組得到了國家高層次海外人才計劃，國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心，清華大學(xué)篤實(shí)計劃，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心，北京分子科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究基金等基金支持。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202409282
