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結(jié)核病 (Tuberculosis，TB)是由單一病原體結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的傳染病。結(jié)核病最常見的是肺結(jié)核 (pulmonary TB)，會導(dǎo)致肺組織破壞，出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血等癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)展為呼吸衰竭。若未及時(shí)治療，結(jié)核菌可傳播至其他器官，導(dǎo)致結(jié)核性腦膜炎、骨結(jié)核、腎結(jié)核等。WHO研究報(bào)告顯示，2023年全球約有1080萬的新發(fā)結(jié)核病例和125萬的死亡病例[1]。自新冠之后 (COVID-19，2020 to 2021)，TB再次成為致死人數(shù)最多的單一病原體感染引起的疾病[2]。

菌學(xué)診斷是結(jié)核病確診的金標(biāo)準(zhǔn)，其中用于染色結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分的金胺O法，已沿用超過百年。自2014年WHO在全球推廣Xpert MTB/RIF技術(shù)以來，結(jié)核病的診斷和年度新發(fā)病例的減少效率并未顯著提升，可能的原因包括：一是該技術(shù)檢測成本昂貴，在TB高負(fù)擔(dān)國家和地區(qū)普及困難，二是，高達(dá)約三分之一的新確診結(jié)核病患者已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性，該法并不能給出藥敏結(jié)果，用于精準(zhǔn)指導(dǎo)用藥。因此，快速、高靈敏度的細(xì)菌學(xué)檢測方法仍然是研究的重點(diǎn)。單細(xì)胞熒光診斷技術(shù)因其高靈敏度、高特異性、快速檢測及較低成本等優(yōu)勢，備受期待。目前雖然報(bào)道了一些基于代謝途徑和酶開關(guān)機(jī)制的Mtb熒光探針，但其靈敏度較低 (>100 μM)，響應(yīng)時(shí)間長(>1 h)，且停留在實(shí)驗(yàn)室水平，尚無臨床轉(zhuǎn)化的成果。

劉剛教授課題組長期致力于新型結(jié)核熒光探針的研究，先前報(bào)道了多個(gè)基于特異性硝基還原酶開關(guān)機(jī)制的新型Mtb熒光探針（Analytic Chemistry, 2024, 96, 4, 1576-1586；Chem Commun (Camb). 2021, 57, 13174-13177.）及藥敏實(shí)驗(yàn)方法（ACS Infect. Dis. 2019, 5(6), 949-961），同時(shí)實(shí)現(xiàn)了良好的標(biāo)記宿主細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌能力。這些熒光團(tuán)包括香豆素探針、花菁熒光探針及羅丹明熒光探針。

本研究則聚焦于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜上的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IrtAB，利用其主動從外環(huán)境攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)極微量鐵離子的機(jī)制，開發(fā)出一種超靈敏且快速的新型熒光試劑

研究首先對結(jié)核分枝桿菌自身分泌的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IrtAB天然配體mycobactin (MbT)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，并在分子骨架上分別引入S構(gòu)型、R構(gòu)型甲基，合成了不同的MbT類似物（圖1），實(shí)現(xiàn)了該類多肽化合物的克級制備能力。研究系統(tǒng)考察了紅色熒光團(tuán)，包括花菁系列熒光團(tuán) (Cy)和羅丹明系列熒光團(tuán) (Rho)，設(shè)計(jì)并合成了系列MbT-熒光團(tuán)共綴探針 (MbTCFps，圖2)。

圖1 MbT類似物的化學(xué)合成

圖2 MbTCFps的化學(xué)結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)新型探針分子N14G相較于其它熒光分子，表現(xiàn)出最強(qiáng)的菌內(nèi)熒光強(qiáng)度，且具有極高的靈敏度，在濃度低至1.0  nM條件下，依舊可以對M. smegmatis菌實(shí)現(xiàn)19倍的熒光增強(qiáng)作用；在10 nM條件下，只需5分鐘的孵育時(shí)間，即可實(shí)現(xiàn)134倍的熒光增強(qiáng)作用。共聚焦熒光顯微鏡成像顯示，N14G對M. smegmatis標(biāo)記主要集中在細(xì)胞膜上，與IrtAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)核菌細(xì)胞膜上高表達(dá)密切相關(guān)。延長孵育時(shí)間至24小時(shí)，N14G依舊具有良好的熒光標(biāo)記能力，證明N14G在孵育過程中具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性和光學(xué)穩(wěn)定性。熱致死和抗TB藥物處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)菌在死亡/損傷條件下，對N14G的攝取顯著降低，再次驗(yàn)證了MbT轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)/膜結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān)（圖3）。

圖3. MbTCFps的熒光標(biāo)記能力

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MbTCFps螯合三價(jià)鐵離子(Fe³⁺)后可有效淬滅此類分子的熒光，并且合成的N14G-Fe （圖4）也能夠在N14G-F菌內(nèi)產(chǎn)生熒光，特異地標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌。相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N14G-Fe可以被IrtAB蛋白還原并實(shí)現(xiàn)熒光信號的開啟，不僅驗(yàn)證了引入鐵離子開關(guān)的可行性，也證明了IrtAB蛋白同時(shí)具備轉(zhuǎn)運(yùn)和還原Fe3?的雙重功能（圖4）。

圖4. “鐵開關(guān)”熒光探針N14G-Fe的結(jié)構(gòu)和功能驗(yàn)證

分子對接顯示，N14G和N14G-Fe和IrtAB蛋白的結(jié)合部分(SID)均有較強(qiáng)的相互作用。采用IrtAB的敲除菌和回補(bǔ)菌再一次研究證明，熒光的產(chǎn)生依賴于IrtAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖5）。

圖5. IrtAB蛋白的功能驗(yàn)證

與北京胸科醫(yī)院孫照剛教授合作研究證明，N14G和N14G-Fe對結(jié)核分枝桿菌野生株H37Rv的檢測限為34個(gè)菌落。對于臨床TB患者痰液的診斷，N14G和N14G-Fe也只需0.1 μM的濃度及10 分鐘染色時(shí)間就能有效標(biāo)記TB患者痰液中的結(jié)核菌，其靈敏度遠(yuǎn)超現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑金胺O（圖6）。

圖6. TB患者痰液的臨床診斷

本研究以結(jié)核菌的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(IrtAB)為靶點(diǎn)，基于鐵載體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和三價(jià)鐵離子控制的熒光開關(guān)機(jī)制，開發(fā)了新型結(jié)核菌熒光探針。這種熒光探針具有超高靈敏度（1-10 nm）和超快響應(yīng)速度（5-10分鐘）的特點(diǎn)，可用于快速檢測結(jié)核分枝桿菌，尤其在臨床上可實(shí)現(xiàn)對結(jié)核病患者痰液的快速診斷。

本研究由在讀博士生倪典墨、已畢業(yè)博士生洪小巧等共同作為第一作者完成，并得到了首都醫(yī)科大學(xué)北京胸科醫(yī)院的支持。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金的資助（資助號：81773575, 81573289, 81161120402）以及Bill & Melinda Gates Foundation, TB Drug Accelerator phase I and II: Hit generation for tuberculosis drug discovery, Global health grant number OPP1024029。