最新研究成果

2025年1月6日，清華大學藥學院尹航課題組在Nature Chemical Biology雜志上發(fā)表了題為 “E2–Ub-R74G strategy reveals E2-specific ubiquitin conjugation profiles in live cells” 的研究論文。該研究開發(fā)了Fusion E2-Ub-R74G Profiling （FUSEP）技術(shù)，首次確認酪氨酸泛素化在多種重要人源蛋白中的存在，并提供了一種易用的系統(tǒng)化工具，用于研究賴氨酸和非賴氨酸泛素化修飾。

蛋白質(zhì)泛素化是一種重要且復(fù)雜的一種細胞調(diào)控方式，在信號傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)和癌癥發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，長期以來，泛素化被認為主要發(fā)生在賴氨酸（lysine）上，幾乎與賴氨酸泛素化畫上等號。領(lǐng)域里一直推測和尋找酪氨酸（tyrosine）上是否存在，一直沒有明確的證據(jù)支持，可能受限于難以用傳統(tǒng)方法進行捕捉，細胞中是否存在酪氨酸泛素化一直是一個未解的長期謎題（圖1），盡管近些年發(fā)現(xiàn)并報道了蘇氨酸（threonine）和脂多糖（LPS）等非賴氨酸泛素化研究的證據(jù)，領(lǐng)域逐漸形成共識，賴氨酸泛素化可能僅是泛素化修飾的冰山一角^1-6。

2025年1月6日，清華大學藥學院尹航課題組在Nature Chemical Biology雜志上發(fā)表了題為 “E2–Ub-R74G strategy reveals E2-specific ubiquitin conjugation profiles in live cells” 的研究論文。該研究開發(fā)了Fusion E2-Ub-R74G Profiling （FUSEP）技術(shù)，首次確認酪氨酸泛素化在多種重要人源蛋白中的存在，并提供了一種易用的系統(tǒng)化工具，用于研究賴氨酸和非賴氨酸泛素化修飾。

圖1. 代表性的蛋白質(zhì)泛素結(jié)合方式，從左至右分別為已知的賴氨酸（Lysine）泛素化、絲氨酸（Serine）泛素化、蘇氨酸（Threonine）泛素化和未知的酪氨酸（Tyrosine）泛素化

實現(xiàn)E2特異泛素通路的氨基酸級精準解析

泛素化修飾是由通過泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2（超過30種）、泛素連接酶E3（超過600種）依次參與完成的一種高度復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，統(tǒng)稱為總泛素通路。根據(jù)E2酶的種類，該通路可進一步細分為多個E2特異的子通路（圖2）。E2酶通常決定了泛素的結(jié)合方式，包括異肽鍵（賴氨酸lysine）、氧酯鍵（絲氨酸serine/蘇氨酸t(yī)hreonine）或者硫酯鍵（半胱氨酸cysteine）。因此，E2酶是開發(fā)泛素化研究工具的理想切入點。如今已知約30種的E2通路，形成了一個有益的研究框架。然而，盡管近年來非賴氨酸泛素化的研究取得一定進展，相關(guān)的研究工具和檢測技術(shù)仍然相對匱乏，這為深入探索泛素化修飾的多樣性和生物學功能帶來了挑戰(zhàn)。

圖2. 總泛素通路（Cellular ubiquitome）可進一步根據(jù)E2酶細分為超過30種的E2子通路（E2-specific ubiquitome）

為了解決當前技術(shù)瓶頸，研究者通過理性設(shè)計，開發(fā)了FUSEP（Fusion E2-Ub-R74G Profiling）技術(shù)。這一技術(shù)專門針對非賴氨酸泛素化的獨特化學特性，優(yōu)化了質(zhì)譜樣品制備、檢測和分析方法。通過FUSEP技術(shù)，研究者成功揭示了酪氨酸泛素化在多個重要人源蛋白上存在的面紗，如SKP-CUL1-F-box（SCF）E3酶復(fù)合體的成分CUL1和CAND1、線性泛素鏈組裝復(fù)合體LUBAC的成員HOIL1和HOIP，以及O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶OGT等蛋白的多個位點。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解泛素化的多樣性和機制提供了重要線索。

FUSEP策略的核心在于設(shè)計了一種含有Ub-R74G點突變的特異探針，能夠在活細胞中原位標記E2酶的底物蛋白。通過質(zhì)譜胰酶消化后，該探針可在修飾位點留下特異的LGGG殘基，從而與內(nèi)源性泛素修飾產(chǎn)生的GG殘基區(qū)分開來（圖3）。這一技術(shù)結(jié)合高精度質(zhì)譜分析，不僅可以解析傳統(tǒng)賴氨酸泛素化，還能通過羥胺（NH2OH）處理消除非賴氨酸泛素化修飾，從而揭示了E2酶（如UBE2D3和UBE2Z）在細胞內(nèi)的非賴氨酸泛素化功能。

FUSEP技術(shù)的開發(fā)為研究E2特異泛素化通路提供了一種前所未有的工具，能夠?qū)崿F(xiàn)氨基酸級分辨率的精準解析。這一技術(shù)不僅推動了對賴氨酸和非賴氨酸泛素化的理解，還為揭示酪氨酸泛素化的分子機制及其潛在生物學功能奠定了重要基礎(chǔ)。

圖3. E2-Ub-R74G探針經(jīng)質(zhì)譜胰酶消化后形成LGGG殘基，與內(nèi)源泛素修飾留下的GG殘基區(qū)分，可精確到具體氨基酸位點

揭示酪氨酸泛素化的神秘面紗

在人類細胞中，研究者通過FUSEP技術(shù)首次揭示了一種新型的翻譯后修飾——酪氨酸泛素化——在多個重要蛋白的多個位點上的存在。比如SCF E3復(fù)合體為例，F(xiàn)USEP揭示了CUL1蛋白在多個位置上，尤其是其高度保守的99號位點酪氨酸殘基上發(fā)生了酪氨酸泛素化，這一發(fā)現(xiàn)得到了內(nèi)源泛素（GG）修飾的酪氨酸殘基數(shù)據(jù)的支持（圖4）。這一新發(fā)現(xiàn)表明，與傳統(tǒng)的賴氨酸泛素化相比，酪氨酸泛素化在調(diào)控CUL1活性方面可能展現(xiàn)出潛在獨特的化學和生物學特性。這一發(fā)現(xiàn)進一步驗證了FUSEP作為一種有效工具的價值，該技術(shù)能夠在原位深入研究E2特異的賴氨酸和非賴氨酸泛素化連接方式，為擴展對泛素結(jié)合方式——泛素生物學中的核心問題——的理解提供了新的視角。

FUSEP的開發(fā)為酪氨酸泛素化——當前幾乎完全未知——的研究開辟了新的可能性。這一發(fā)現(xiàn)促使人們思考酪氨酸泛素化是否具有獨特的生物學功能和分子機制，同時為解決因檢測工具匱乏而長期未解的科學難題提供了新的動力。由于非賴氨酸泛素化的化學穩(wěn)定性較低且生物學功能尚未完全明確，相關(guān)研究一直處于探索階段。然而，正如2022年Nature Chemical Biology中的展望文章“A new dawn beyond lysine ubiquitination”、2024年Nature Structural & Molecular Biology的評論文章“Just how big is the ubiquitin system?”、2024年2月刊的Nature Structural & Molecular Biology關(guān)于泛素化的專題“Understanding writers and readers of ubiquitylation”所討論的，隨著技術(shù)的進步，未來這一領(lǐng)域有望吸引不同技術(shù)背景和專長的科研人員共同推進其發(fā)展。

圖4. （左）CUL1蛋白Y126位點的泛素殘基GG修飾譜圖 ;（右）不同CUL1蛋白的泛素化條帶比較：CUL1-Y99、CUL1-F99（缺乏形成氧酯鍵的羥基）和CUL1-K99（酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔渲蠧UL1-F99呈現(xiàn)較低的泛素化（HMW CUL1）對無泛素化（neat CUL1）比值

簡便易用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與探針電轉(zhuǎn)方法，適用于多種實驗場景

FUSEP技術(shù)經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，旨在實現(xiàn)簡便易用，適用于典型細胞、分子生物學及生物化學實驗平臺。該技術(shù)能夠方便地將探針編碼至傳統(tǒng)的分子生物學過表達載體中，便于后續(xù)序列改造：1. 對于易轉(zhuǎn)染的細胞（如常見細胞系），可以通過經(jīng)典的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法進行探針的過表達，操作與常規(guī)細胞表達方法接近，包括細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染步驟。探針表達僅需使用標準的20種氨基酸。2. 對于較難轉(zhuǎn)染細胞（如THP-1細胞），可以采用電穿孔技術(shù)進行蛋白探針的導(dǎo)入。此外，蛋白探針還可應(yīng)用于裂解液中的FUSEP鑒定，進一步擴展了應(yīng)用范圍。

揭示單次跨膜E3蛋白在細胞焦亡中的潛在作用

除了上述發(fā)現(xiàn)，研究者還利用FUSEP技術(shù)深入研究了單次跨膜E3蛋白RNF149與UBE2D3的配對，探討其在細胞凋亡過程中對斑點樣細胞凋亡相關(guān)蛋白（ASC）泛素降解的影響。通過shRNA穩(wěn)定敲低RNF149的THP-1細胞系，研究者觀察到ASC蛋白水平顯著上升，進而影響了細胞焦亡過程。近年來，細胞膜上的單次跨膜E3蛋白因其在細胞膜上對抗體等干預(yù)手段的優(yōu)勢，以及其相對獨特的序列和底物特異性，吸引了包括AbTAC、PROTAB在內(nèi)的技術(shù)開發(fā)。然而，關(guān)于其調(diào)控機制和下游底物的系統(tǒng)研究仍較為缺乏。該發(fā)現(xiàn)不僅為深入理解細胞凋亡的分子機制提供了新的視角，也為未來的潛在治療應(yīng)用開辟了新的可能性。

總體而言，F(xiàn)USEP技術(shù)為研究酪氨酸（tyrosine）泛素化提供了全新的視角和必要的工具。酪氨酸泛素化長期以來未得到明確證實，主要由于其在細胞中的化學特性使得傳統(tǒng)的檢測方法難以捕捉。FUSEP通過精確的探針設(shè)計和優(yōu)化的質(zhì)譜分析，首次揭示了酪氨酸泛素化在多個關(guān)鍵人源蛋白上（CUL1、CAND1、HOIL1、HOIP和OGT）的存在，尤其在SCF E3復(fù)合體中的CUL1蛋白上，發(fā)現(xiàn)了酪氨酸泛素化修飾。該技術(shù)不僅為酪氨酸泛素化的分子機制提供了的研究工具，也推動了非賴氨酸泛素化研究的進展。FUSEP技術(shù)的簡便易用和高靈敏度，使其成為探索復(fù)雜泛素化修飾的一種有效方法，有望在未來的研究中發(fā)揮重要作用，進一步深化對泛素化修飾多樣性及其生物學功能的理解。

Acknowledgements

專家點評