Caspase-4（半胱天冬酶-4）是炎癥性caspase家族的重要成員，在人類固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮核心作用。它通過直接識別革蘭氏陰性菌脂多糖（LPS）激活非經(jīng)典炎癥通路，進(jìn)而切割Gasdermin D（GSDMD）并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡（pyroptosis）和炎癥因子釋放。盡管底物鑒定對解析Caspase-4的生物學(xué)功能與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要，但由于酶-底物相互作用瞬時(shí)性及切割效率低下等挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)基于酶切產(chǎn)物富集的方法難以系統(tǒng)揭示其底物譜系。

2025年3月12日，清華大學(xué)尹航課題組在Angew. Chem. Int. Ed.發(fā)表研究，創(chuàng)新性地將基因密碼子擴(kuò)展與光交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合，開發(fā)了一種高效捕獲Caspase底物的新方法。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)酶活性依賴策略的局限性，為焦亡及相關(guān)信號通路研究提供了強(qiáng)有力的工具。

作者基于Caspase-4與底物GSDMD的互作界面，利用基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)，將光敏非天然氨基酸pBpa精準(zhǔn)嵌入Caspase-4的底物結(jié)合區(qū)域（K356位點(diǎn)），構(gòu)建了光交聯(lián)探針CASP4(C258A)-3C-pBpa。并巧妙引入三重功能模塊：1）通過C258A催化位點(diǎn)突變消除蛋白酶活性，避免底物降解導(dǎo)致的信號丟失；2）插入HRV-3C蛋白酶切割位點(diǎn)維持天然構(gòu)象與底物結(jié)合能力；3）利用pBpa的光交聯(lián)特性共價(jià)鎖定瞬時(shí)相互作用。該探針成功克服傳統(tǒng)方法的技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)了對弱結(jié)合底物的高效捕獲。

圖1.光交聯(lián)探針設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

作者首先采用高分辨質(zhì)譜等技術(shù)對構(gòu)建的光交聯(lián)探針進(jìn)行分子表征，確認(rèn)探針的分子量及結(jié)構(gòu)完整性。通過底物切割實(shí)驗(yàn)與蛋白質(zhì)互作分析，證實(shí)探針的結(jié)構(gòu)修飾（包括催化位點(diǎn)失活突變與蛋白酶切位點(diǎn)插入）未影響Caspase-4的天然構(gòu)象與功能特性。體外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)顯示，該探針能夠在紫外激活下高效捕獲已知底物GSDMD，并系統(tǒng)性富集裂解液中的相互作用蛋白，展現(xiàn)出顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法的底物捕獲能力。

結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)（Label-Free Quantification, LFQ），作者從THP-1細(xì)胞裂解液中鑒定出156種潛在底物。為驗(yàn)證技術(shù)可靠性，作者選取部分候選蛋白進(jìn)行體外切割實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了包括AKT1、CASP5/12在內(nèi)的16種蛋白可被Caspase-4切割。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅驗(yàn)證了光交聯(lián)探針技術(shù)的高效性與準(zhǔn)確性，更通過新底物的發(fā)現(xiàn)為解析焦亡通路中酶-底物結(jié)合特異性、信號交叉調(diào)控等關(guān)鍵科學(xué)問題提供了重要線索。

圖2.組學(xué)分析與底物驗(yàn)證

在眾多新發(fā)現(xiàn)的底物中，尤其值得關(guān)注的是，研究首次揭示Caspase-4可通過特異性切割A(yù)KT1的D108位點(diǎn)，移除其PH自抑制結(jié)構(gòu)域，釋放激酶活性核心。這一發(fā)現(xiàn)提示細(xì)胞焦亡通路可能通過AKT1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與細(xì)胞存活、代謝等進(jìn)程產(chǎn)生交叉對話。此外，Caspase-4對同家族蛋白酶Caspase-5/12前體的激活作用，揭示了炎癥性caspase間存在級聯(lián)放大機(jī)制，為先天免疫應(yīng)答調(diào)控提供了新視角。