最新科研速遞
細胞外蛋白（包括分泌蛋白與跨膜蛋白）在多細胞生物的生理調(diào)控中具有重要作用，其通過介導(dǎo)細胞間通訊協(xié)調(diào)復(fù)雜生理過程。病理狀態(tài)下，細胞外蛋白的異常表達或修飾與癌癥、神經(jīng)退行性疾病及心血管疾病等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。值得注意的是，超過60%的FDA批準藥物靶向細胞外蛋白，因此系統(tǒng)解析細胞外蛋白質(zhì)組對闡明生物過程分子機制、揭示疾病病理基礎(chǔ)及開發(fā)靶向治療策略具有重要意義。
近年來，盡管鄰近標記酶（proximity labeling enzymes）和小分子光催化劑技術(shù)的發(fā)展促進了細胞外蛋白質(zhì)組的解析，但這些方法的體內(nèi)應(yīng)用仍存在局限性。辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）的標記依賴具有細胞毒性的過氧化氫（圖1a），限制了其在活體動物中的直接使用；而生物素連接酶（如 BioID和 TurboID），雖然可以實現(xiàn)活體細胞內(nèi)蛋白的標記，卻因細胞外微環(huán)境中ATP濃度不足導(dǎo)致胞外標記效率受限。此外，內(nèi)源性生物素或過氧化氫均可能出現(xiàn)較高的背景干擾。可見光在活體組織中的穿透深度有限，光催化劑在體內(nèi)的應(yīng)用也面臨挑戰(zhàn)。
2025年3月15日，清華大學藥學院秦為課題組在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為 “Spatiotemporally resolved mapping of extracellular proteomes via in vivo-compatible TyroID” 的研究論文。該研究開發(fā)了一種無毒的鄰近標記技術(shù)TyroID，實現(xiàn)了活體內(nèi)細胞外蛋白質(zhì)組的高時空分辨率解析，該技術(shù)成功應(yīng)用于活體腫瘤異種移植模型HER2鄰近蛋白動態(tài)解析、血漿蛋白代謝追蹤及小鼠海馬區(qū)特異性蛋白質(zhì)組標記，解決了傳統(tǒng)鄰近標記技術(shù)在解析細胞外蛋白質(zhì)組的活體兼容性問題。
此研究發(fā)展了一種新型活體鄰近標記技術(shù)TyroID（圖1b），用于實現(xiàn)細胞外蛋白質(zhì)組的時空動態(tài)解析。TyroID 技術(shù)的核心是基于植物或細菌來源的酪氨酸酶（tyrosinase），其可以將生物正交的苯酚底物氧化為高反應(yīng)活性的鄰醌（o-quinone），特異性標記鄰近蛋白中半胱氨酸、賴氨酸及組氨酸等親核氨基酸。與傳統(tǒng)鄰近標記技術(shù)相比，TyroID無需依賴過氧化氫或可見光等外源激活條件，僅需添加酚類底物即可完成原位標記。
圖1. （a）過氧化物酶（如 APEX 和 HRP）標記示意圖；（b）TyroID標記示意圖
針對常規(guī)探針AP易滲入胞內(nèi)的缺陷，團隊開發(fā)了膜非通透型探針"AxxP"——通過引入四聚乙二醇連接臂阻斷跨膜擴散。實驗證明，75nM abmTYR聯(lián)合50μM AxxP能在30分鐘內(nèi)實現(xiàn)乳腺癌細胞表面蛋白的特異性標記，與膜標志物GLUT1呈高度共定位，且維持生理狀態(tài)下的蛋白空間分布。基于二甲基化定量蛋白質(zhì)組學，TyroID系統(tǒng)成功鑒定315個高置信度細胞外蛋白。通過super-TOPP-ABPP技術(shù)解析的修飾位點均位于蛋白胞外域，證明該方法具備解析跨膜蛋白拓撲結(jié)構(gòu)的獨特能力。該研究進一步將TyroID應(yīng)用于HER2受體鄰近蛋白組解析，通過抗體靶向策略識別出LGALS1、FUS等HER2互作蛋白，并經(jīng)Co-IP實驗驗證其結(jié)合強度與經(jīng)典互作蛋白TFRC相當。
最后，基于TyroID無毒、快速標記的優(yōu)勢，團隊探索了其在活體中的應(yīng)用，這是基于過氧化物酶和可見光激活的鄰近標記方法難以實現(xiàn)的。為此，作者設(shè)計了三項獨立的活體實驗，以驗證TyroID在活體小鼠中應(yīng)用的有效性：1）活體腫瘤中HER2鄰近蛋白的分析，鑒定出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶（VCP）、鈣調(diào)理蛋白2（CNN2）及分選連接蛋白9（SNX9）等在細胞培養(yǎng)實驗中未發(fā)現(xiàn)的HER2鄰近蛋白；2）定量分析44種血漿蛋白的turnover速率，揭示Apoc3、Apoa4和Apoe等載脂蛋白的高代謝特性；3）海馬區(qū)原位標記叢蛋白A1（Plxna1）、神經(jīng)軟骨蛋白（Ncdn）及神經(jīng)元膜糖蛋白M6-a（Gpm6a）等腦特異性蛋白。
圖2. TyroID在活體內(nèi)的應(yīng)用
綜上，TyroID通過酶促生成鄰醌實現(xiàn)無毒、快速的細胞外標記，突破了傳統(tǒng)技術(shù)對H?O?或可見光的依賴，為活體蛋白質(zhì)組動態(tài)解析提供了創(chuàng)新工具。其在腫瘤微環(huán)境研究、血漿蛋白周轉(zhuǎn)監(jiān)測及神經(jīng)生物學領(lǐng)域的應(yīng)用，展現(xiàn)了廣闊的研究潛力。
生命中心、清華大學藥學院秦為助理教授為本文的通訊作者。中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所武照伐研究員為本文提供了重要實驗幫助。清華大學藥學院博士生張梓涓和博士后王妍坤為論文的第一作者。清華大學陸文捷, 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所王曉飛博士, 清華大學博士生郭弘揚，博士后潘宣圳, 博士生劉澤瑜為本文提供了重要實驗和數(shù)據(jù)分析幫助。北京大學陳興教授課題組提供了細胞系支持。王初課題組的專職副研究員劉源博士、博士后肖偉弟博士（現(xiàn)為北京大學成都前沿交叉生物技術(shù)研究院研究員），以及王初教授提供了superTOP-ABPP實驗的技術(shù)指導(dǎo)。秦為課題組得到了國家高層次海外人才計劃，國家重點研發(fā)計劃青年科學家項目，國家自然科學基金重大研究計劃培育項目，面上項目，青年基金項目，中國博士后面上項目，清華-北大生命科學聯(lián)合中心，清華大學篤實計劃，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心，北京分子科學國家實驗室基礎(chǔ)研究基金，深圳市醫(yī)學研究基金等基金支持。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-57767-w
