清華大學尹航教授和張瑩助理研究員的科研團隊近期在《Advanced Science》上發(fā)表研究，首次揭示了Nucleophosmin 1（NPM1）通過識別特定RNA基序并誘導相分離，進而介導mRNA被選擇性分選進入EVs的分子機制。研究還發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌（NSCLC）患者血清來源的EVs中，NPM1蛋白與EGFR mRNA水平顯著升高，提示該機制在肺癌進展中可能發(fā)揮重要作用。
細胞外囊泡（EVs）是細胞間通訊的重要媒介，能夠攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)與核酸等生物活性分子，影響免疫應(yīng)答、發(fā)育調(diào)控及疾病進程等多種生理病理過程。盡管已有研究表明EVs可遞送功能性mRNA至受體細胞，但mRNA是如何被選擇性裝載入EVs的具體機制尚不清楚。解析這一機制對于理解EVs的生物學功能及其在疾病治療中的應(yīng)用具有重要意義。
圖1：NPM1被鑒定為EV中mRNA結(jié)合蛋白
研究通過寡聚dT捕獲技術(shù)與蛋白質(zhì)組學分析，從HeLa細胞來源的EVs中鑒定出100多個與poly(A) RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。進一步篩選發(fā)現(xiàn)其中NPM1的敲低顯著降低EVs中mRNA水平，提示NPM1可能參與mRNA向EVs的裝載過程。
圖2：NPM1選擇性分選mRNA進入EVs
通過CRISPR-Cas9構(gòu)建NPM1敲除細胞系，RNA-seq分析顯示NPM1缺失導致EVs中多個癌癥相關(guān)mRNA（如EGFR、IGF2R、TLK2）水平下降。RNA免疫共沉淀實驗證實NPM1與這些mRNA直接結(jié)合。RT-qPCR與流式細胞分析技術(shù)證實NPM1可攜帶這些mRNA進入到受體細胞中。
圖3：NSCLC患者血清EVs中NPM1與EGFR mRNA水平正相關(guān)
在18例NSCLC患者與18例健康對照的血清EVs中，NPM1蛋白與EGFR mRNA水平均顯著升高，且兩者呈正相關(guān)，提示該機制在肺癌中具有潛在臨床意義。
圖4：鑒定NPM1結(jié)合的RNA基序及其功能驗證
通過生物信息學分析鑒定出一個8核苷酸基序“CUGGGAUU”，該基序在EGFR等癌癥相關(guān)mRNA中存在。通過RNA-pulldown技術(shù)驗證NPM1與該基序的特異性結(jié)合能力。利用Cre-LoxP報告系統(tǒng)驗證，將該基序連接至Cre mRNA的3’端可顯著增強其通過EVs遞送至受體細胞的效率，且該過程對NPM1具有依賴性。
圖5：NPM1與mRNA共定位于晚期內(nèi)體與多囊泡體
蔗糖密度梯度離心與高分辨率顯微成像顯示，NPM1與RNA在細胞內(nèi)共定位并主要富集于CD63標記的多囊泡體中，提示NPM1-mRNA復(fù)合物通過晚期內(nèi)體-多囊泡體途徑進入EVs。
圖6：NPM1與RNA形成相分離凝聚體并招募MVB膜
體外實驗表明，NPM1可通過其固有無序區(qū)域與RNA形成動態(tài)液相凝聚體。RNA在凝聚體形成的過程中起促進功能。活細胞成像進一步顯示，NPM1-RNA凝聚體可招募CD63標記的多囊泡體膜，促進其包裝進入EVs。
NPM1的異常功能與多種惡性腫瘤的發(fā)病相關(guān)。本研究系統(tǒng)闡明了細胞質(zhì)內(nèi)NPM1通過識別RNA基序、形成相分離凝聚體并導向多囊泡體途徑，從而介導mRNA選擇性分選進入EVs的完整機制。該發(fā)現(xiàn)不僅深化了對EVs 內(nèi)容物分選機制的理解，也為基于EVs的RNA遞送與腫瘤治療策略提供了新思路。
本文第一作者為清華大學藥學院博士生張凱翔，合作者包括清華大學生命科學院魯志副教授、北京大學第一醫(yī)院胸外科與胃腸外科臨床團隊，研究獲得國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金等資助。
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.2024xxxxx
