1） 液液相分離 (liquid-liquid phase separation, LLPS)是生物大分子在真核細(xì)胞中聚集形成無(wú)膜細(xì)胞器的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞區(qū)域化的重要機(jī)制，展現(xiàn)了真核細(xì)胞對(duì)各種生理活動(dòng)的精準(zhǔn)、動(dòng)態(tài)的時(shí)空調(diào)控。當(dāng)前，如何建立相分離現(xiàn)象和生物學(xué)功能之間的關(guān)系是該領(lǐng)域內(nèi)的重要科學(xué)問(wèn)題。相分離對(duì)系統(tǒng)計(jì)量高度依賴(lài)，各組分形成分相的臨界濃度尤為關(guān)鍵，因此需要高效、快速、動(dòng)態(tài)的擾動(dòng)技術(shù)的支持。此外，如何避免體外實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能、探究生理?xiàng)l件下的相分離狀態(tài)、剖析分相液滴中支架蛋白與乘客蛋白身份和功能的轉(zhuǎn)換及其內(nèi)在分子機(jī)制等問(wèn)題都迫切需要新技術(shù)和新方法的建立。現(xiàn)有技術(shù)手段如CRISPR-Cas9/RNA干擾（RNAi）等遺傳學(xué)工具在體內(nèi)直接研究相分離面臨很多挑戰(zhàn)，如相分離領(lǐng)域仍然缺乏在野生型細(xì)胞系上直接干擾LLPS的高效方法。在該工作中，本課題組建立了“PROTAC-target protein-LLPS”的研究方法，以期從多維度探究LLPS相關(guān)的內(nèi)源蛋白-蛋白相互作用、蛋白時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控的精密機(jī)制。在LLPS研究中，基于PROTAC的研究方法快速、高效、可逆，優(yōu)于傳統(tǒng)遺傳學(xué)工具對(duì)靶基因的擾動(dòng)；同時(shí)，相較于常用解聚凝聚體的小分子（如1,6-己二醇），PROTAC也更具有特異性和靶向性。另外，將此方法與多組學(xué)手段聯(lián)合分析，不僅能夠探究凝聚物中各組分之間的互作和功能伴隨，而且將為相分離與生物功能之間建立因果關(guān)系提供可能。這是PROTAC在LLPS研究中的首次運(yùn)用，為解決領(lǐng)域內(nèi)關(guān)鍵問(wèn)題提供了新方法和新見(jiàn)解。（ 代表性工作：Cell Discovery, 2023, 9, DOI: 10.1038/s41421-023-00544-0.)。

圖一 BRD4-PROTACs工作模型示意圖

2） 開(kāi)發(fā)雙靶雙機(jī)制小分子降解劑。靶向蛋白降解是以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，用小分子降解劑誘導(dǎo)靶蛋白降解的一種技術(shù)，其中最主要的兩種降解機(jī)制包括PROTAC和分子膠。PROTAC分子由三部分組成，PROTAC分子可將靶蛋白錨定到E3泛素連接酶進(jìn)而誘導(dǎo)其泛素化降解。與PROTAC類(lèi)似，分子膠是單一的小分子片段，分子量較小，它通過(guò)誘導(dǎo)靶蛋白與E3泛素連接酶之間形成較為緊密的蛋白-蛋白相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)泛素化降解。這兩種蛋白降解技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，例如PROTAC適于理性設(shè)計(jì)，但由于分子量偏大，導(dǎo)致成藥性不足。分子膠分子量小，成藥性好，且能降解難成藥靶點(diǎn)，可以彌補(bǔ)PROTAC的不足，但由于需要在兩個(gè)蛋白之間誘導(dǎo)形成一個(gè)結(jié)合口袋，設(shè)計(jì)難度大。如何平衡二者的優(yōu)劣之處使靶向降解技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展是一個(gè)重要的問(wèn)題。為打破現(xiàn)有技術(shù)的桎梏，本課題組在此工作中首次提出了將PROTAC分子與分子膠相融合的概念。根據(jù)PROTAC和分子膠的特點(diǎn)設(shè)計(jì)合成了一系列雙靶、雙機(jī)制的降解劑，這類(lèi)新型降解劑既保留了降解BTK的PROTAC活性，又兼具降解GSPT1的分子膠特點(diǎn)，以PROTAC的思路設(shè)計(jì)合成雙機(jī)制降解劑解決了分子膠設(shè)計(jì)難度大的問(wèn)題，而作為分子膠降解GSPT1也補(bǔ)充了PROTAC在生物活性上的不足，對(duì)難治性腫瘤的臨床治療具有潛在重要意義。該雙機(jī)制降解劑開(kāi)發(fā)也為靶向降解技術(shù)的發(fā)展開(kāi)拓了新的思路。（ 代表性工作：Cell Research, 2021, 25, 1315-1318. DOI: 10.1038/s41422-021-00533-6.)。

圖二 發(fā)展雙靶雙機(jī)制小分子降解劑

3） 靶向CDK2誘導(dǎo)AML分化的PROTAC小分子探針研究。AML是一種常見(jiàn)的血液癌癥，該病以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細(xì)胞異常增生為主要特征。該疾病以蒽環(huán)類(lèi)和胞苷藥物聯(lián)合化療為主要臨床治療方案。該治療方案一定程度上是有效的，但也存在嚴(yán)重的毒副作用，5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%。近期研究表明CDK2是一個(gè)潛在的分化治療靶點(diǎn)。但是，由于CDK蛋白的高度同源性及ATP結(jié)合口袋的相似性，傳統(tǒng)小分子抑制劑難以實(shí)現(xiàn)高選擇性。傳統(tǒng)激酶抑制劑通過(guò)多靶點(diǎn)協(xié)同抑制發(fā)揮功能，存在嚴(yán)重毒性，臨床治療和科研中尚無(wú)CDK2選擇性的抑制劑。本課題組通過(guò)構(gòu)建新型小分子靶向CDK2蛋白高效降解劑，從分化治療角度為急性髓系白血病（AML）治療提供了一種可能的治療手段。代表性的CDK2蛋白降解劑CPS2可以在多種AML細(xì)胞系中以小于10 nM的DC₅₀高效選擇性降解CDK2蛋白。區(qū)別于傳統(tǒng)小分子抑制劑，CPS2可顯著抑制細(xì)胞增殖，且不會(huì)引起顯著的細(xì)胞凋亡。該分子在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)出了良好的安全性，且對(duì)HSCs的生存無(wú)顯著性影響。更為重要的是，代表性化合物CPS2可引起AML細(xì)胞的分化，該分化指標(biāo)可通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞染色和表面標(biāo)記物等多個(gè)維度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，這為AML的治療提供一種新的分化治療的先導(dǎo)化合物。該工作基于蛋白質(zhì)降解技術(shù)解決了長(zhǎng)期以來(lái)的靶向CDK2的選擇性難題，提供了一種可行的AML分化治療先導(dǎo)化合物。除AML治療外，該類(lèi)降解劑或可在CDK2相關(guān)的其它疾病治療領(lǐng)域也發(fā)揮重要功能。（ 代表性工作：Nature Chemical Biology, 2021, 16, 567-575. DOI: 10.1038/s41589-021-00742-5.）。

圖三 CDK2選擇性降解劑誘導(dǎo)AML細(xì)胞實(shí)現(xiàn)分化

4）開(kāi)發(fā)小分子蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)（PROTACs）克服Ibrutinib耐藥的B細(xì)胞惡性腫瘤。非霍奇金淋巴瘤（NHL）是B細(xì)胞惡性腫瘤的一種， 2015年引起全球約23萬(wàn)人死亡，僅美國(guó)每年新增病例6萬(wàn)余人。自從2013年被FDA批準(zhǔn)，BTK共價(jià)抑制劑Ibrutinib一直是治療多種非霍奇金淋巴瘤的一線(xiàn)用藥，包括套細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、華氏巨球蛋白血癥。盡管如此，根據(jù)最新的臨床數(shù)據(jù)報(bào)道，針對(duì)Ibrutinib已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性。由于BTK蛋白481位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸（C481S），使得Ibrutinib的活性下降近500倍，臨床數(shù)據(jù)已經(jīng)證明這一突變是病人產(chǎn)生對(duì)Ibrutinib耐藥的根本原因。本課題組通過(guò)構(gòu)建新型小分子靶向蛋白降解劑，招募E3泛素化連接酶靶向降解BTK蛋白。新構(gòu)建的BTK蛋白降解劑可以在多種B細(xì)胞惡性腫瘤中高效降解BTK蛋白。小分子蛋白降解劑對(duì)BTK依賴(lài)的野生型人B細(xì)胞淋巴瘤（HBL-1）細(xì)胞的抑制活性與臨床一線(xiàn)用藥Ibrutinib相當(dāng)。更為重要的是，新策略可以靶向降解C481S突變的BTK蛋白，克服B細(xì)胞惡性腫瘤BTK激酶由于C481S突變引起的對(duì)臨床一線(xiàn)藥物Ibrutinib的耐藥性（圖一）。該工作為基于蛋白質(zhì)降解技術(shù)進(jìn)行抗耐藥B細(xì)胞惡性腫瘤的藥物研發(fā)提供了重要信息。（ 代表性工作：Cell Research,2018, 22. 779–781； Leukemia, 2019, 33, DOI: 10.1038/s41375-019-0440-x.)。

圖四 開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)（PROTACs）克服Ibrutinib耐藥的B細(xì)胞惡性腫瘤

1. Y. Shi, Y. Liao, Q. Liu, Z. Ni, Z. Zhang, M. Shi, P. Li*, H. Li*, Y. Rao*, ‘BRD4-targeting PROTAC as a unique tool to study biomolecular condensates’, Cell Discovery, 2023, 9, DOI: 10.1038/s41421-023-00544-0.

2. Z. Yang, Y. Sun, Z. Ni, C. Yang, Y. Tong, Y. Liu, H. Li and Y. Rao*, 'Merging PROTAC and molecular glue for degrading BTK and GSPT1 proteins concurrently', Cell Research, 2021, 25, 1315-1318. DOI: 10.1038/s41422-021-00533-6.

3. L. Wang, X. Shao, T. Zhong, Y. Wu, A. Xu, X. Sun, H. Gao, Y. Liu, T. Lan, Y. Tong, X. Tao, W. Du, W. Wang, Y. Chen, T. Li, X. Meng, H. Deng, B. Yang, Q. He, M. Ying*, Y. Rao*, 'Discovery of a first-in-class CDK2 selective degrader for AML differentiation therapy', Nature Chemical Biology, 2021, 16, Accepted. DOI: 10.1038/s41589-021-00742-5.

4. Y. Yang, H. Gao, X. Sun, Y. Sun, Y. Qiu, Q. Weng*, Y. Rao*, ‘A Global PROTAC Toolbox for Degrading BCR-ABL Overcomes Drug-Resistant Mutants and Adverse Effects’, Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63, accepted. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c00967.

5. M. Li, Y. Yang, Q. Zhao, Y. Wu, L. Song, H. Yang, M. He, H. Gao, B. Song, J. Luo*, Y. Rao*, ‘Degradation Versus Inhibition: Development of Proteolysis-Targeting Chimeras for Overcoming Statin-Induced Compensatory Upregulation of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase’. Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63, accepted. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c00339.

6. S. Su, Z. Y, H. Gao, H. Yang, S. Zhu, Z. An, J. Wang, Q. Li, S. Chandarlapaty, H. Deng, W. Wu*, Y. Rao*, Potent and Preferential Degradation of CDK6 via PROteolysis TArgeting Chimera Degraders. Journal of Medicinal Chemistry, 2019, 62, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b00871.

7. Y. Sun, N. Ding, Y. Song, Z. Yang, W. Liu *, J. Zhu*, Y. Rao*, ‘Degradation of Bruton's tyrosine kinase mutants by PROTACs for potential treatment of ibrutinib-resistant Non-Hodgkin lymphomas’, Leukemia, 2019, 33, DOI: 10.1038/s41375-019-0440-x.

8. X. Sun, J. Wang, X. Yao, W. Zheng, Y. Mao, T. Lan, L. Wang, Y. Sun, X. Zhang, Q. Zhao, J. Zhao, R-P. Xiao, X. Zhang*, G. Ji*, Y. Rao*, ‘A Chemical Approach for Global Protein Knockdown from Mice to Non-human Primates’, Cell Discovery, 2019, DOI: 10.1038/s41421-018-0079-1.

9. Z. An, W. Lv, S. Su, W. Wu*, Y. Rao*, ‘Developing potent PROTACs tools for selective degradation of HDAC6 protein’, Protein & Cell, 2019, DOI: 10.1007/s13238-018-0602-z. Q.

10. Y. Sun, X. Zhao, N. Ding, H. Gao, Y. Wu, Y. Yang, M. Zhao, J. Hwang, Y. Song, W. Liu *, Y. Rao*, ‘PROTAC-Induced BTK Degradation as a Novel Therapy for Mutated BTK C481S Induced Ibrutinib-Resistant B-Cell Malignancies’, Cell Research, 2018, 22, 779–781.